作者：劉維紅 徐引弟 郭愛珍 賈愛卿 劉軍發(fā) 陳煥春

【關(guān)鍵詞】 ，沙門菌；，，，四環(huán)素耐藥基因；，，，tetB；，，，PCR；，，，豬

摘要： 目的 檢測臨床分離豬源致病性沙門菌四環(huán)素的耐藥基因，確定沙門菌四環(huán)素耐藥基因類型。方法 用KB法測定分離株對四環(huán)素等21種抗生素的耐藥情況，用PCR方法檢測四環(huán)素耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG及tetK，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。結(jié)果 臨床分離株全部對四環(huán)素耐藥，33株沙門菌中有29株擴(kuò)增出tetB特異性片段，基因序列與參考菌的同源性為99%，tetB檢測與藥敏試驗(yàn)陽性符合率為879%。結(jié)論 tetB的PCR檢測對四環(huán)素耐藥性具有較高的特異性，tetB基因是決定本試驗(yàn)中臨床分離株四環(huán)素耐藥的主要基因，為四環(huán)素耐藥性的分子流行病學(xué)監(jiān)測提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 沙門菌； 四環(huán)素耐藥基因； tetB； PCR； 豬

PCR amplification of tetB gene forpathogenic Salmonella isolated from diseased pigs

ABSTRACT Objective To detect the tetracycline resistance genes for 33 Salmonella isolates from diseased pigs and define the tetracycline resistance determinants. Methods The resistance of Salmonella isolates were detected by drug susceptibility tests with KirbyBauer (KB) diffusion method. PCR was designed to detect tetA， tetB， tetC， tetD， tetE， tetG and tetK. The amplified products were sequenced and alignment analysis was performed. Results The detection of tetracyclineresistance of 33 Salmonella isolates showed the resistance rate was 100%， but only the tetB was amplified from 29 of 33 isolates. The gene fragment shared 99% homology in nucleotides with the reference sequence. The result of PCR amplification was 879% identical with that of the drug resistance test. Conclusion The tetB was the main determinant responsible for tetracycline resistance in this study and PCR detection of tetB is a specific and reliable method for molecular epidemiology of tetracycline resistance in Salmonella.

KEY WORDS Salmonella; Tetracyclineresistance genes; tetB; PCR; Pigs

自20世紀(jì)40年代抗生素問世以來，它在各種常見細(xì)菌性疾病的治療中發(fā)揮了不可磨滅的作用。但隨著獸用抗生素在養(yǎng)殖業(yè)的廣泛應(yīng)用，它的不良影響和對人類的傷害逐步顯現(xiàn)出來［1］。在人和動物的腸道內(nèi)存在著許多相互制約、處于平衡狀態(tài)的正常菌群，長期過度使用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)，產(chǎn)生耐藥菌群，即便已經(jīng)停止使用相應(yīng)抗生素，這些耐藥菌仍然繼續(xù)傳播耐藥性。同時(shí)致病菌的耐藥性可導(dǎo)致原本有效的抗生素臨床治療失敗［2］。四環(huán)素作為一種廉價(jià)的廣譜抗生素，幾乎占領(lǐng)了三分之二的獸藥領(lǐng)域。隨著它的廣泛應(yīng)用，其耐藥性便成為首當(dāng)其沖的問題［3］。沙門菌是一種重要的腸道病原菌，分布廣，危害大，動物沙門菌是世界各地人類食物中毒的主要致病菌［4］，因此，動物沙門菌的多重耐藥性對動物與人類健康造成嚴(yán)重威脅。檢測四環(huán)素耐藥基因(tet)是監(jiān)測四環(huán)素耐藥性的重要手段。細(xì)菌的四環(huán)素耐藥基因有數(shù)十種之多，隨著細(xì)菌與宿主種類、地理環(huán)境不同而呈現(xiàn)多樣性分布［5～8］。代敏等報(bào)道從某些規(guī)模化豬場分離的豬源致病性沙門菌的四環(huán)素耐藥基因以tetC為主［9］。本實(shí)驗(yàn)室臨床分離了數(shù)十株致病性豬源沙門菌，主要來自于湖北地區(qū)(18株)，涉及七個(gè)省市。其四環(huán)素耐藥基因是否與上述報(bào)道呈現(xiàn)差異尚不清楚。本文用PCR技術(shù)對四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行檢測，以期發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因的分子流行病學(xué)規(guī)律，為有效控制沙門菌感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒豬源沙門菌分離株33株，為本實(shí)驗(yàn)室從臨床疑似沙門菌病的病豬中分離，經(jīng)培養(yǎng)特性和生化特性鑒定及血清型定型確定為不同血清型沙門菌，其中豬霍亂沙門菌21株、鼠傷寒沙門菌8株、豬傷寒沙門菌2株、劍橋沙門菌1株及山夫登堡沙門菌1株。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌大腸埃希菌(ATCC25922)及金黃色葡萄球菌(ATCC25923)購自杭州天和微生物試劑有限公司。大腸埃希菌ER2738［F′ lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf∶∶Tn 10(TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lacproAB)Δ(hsdMSmcrB)5 (rk- m k- McrBC-)］為四環(huán)素耐藥基因tetB的陽性參考菌。質(zhì)粒pBR322 (GenBank登錄號J01749)為tetC的陽性對照。

1.2 主要試劑MH瓊脂、抗生素藥敏紙片與SS瓊脂等購自杭州天和微生物試劑有限公司，LB培養(yǎng)液、TaqE、dNTP等購自大連寶生物有限公司。

1.3 方法(1)藥敏試驗(yàn) 藥敏實(shí)驗(yàn)采用KirbyBauer(KB)紙片擴(kuò)散法［10］。以大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923為藥敏質(zhì)控菌，依據(jù)美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI/NCCLS)2003年頒布的判定標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)等三種藥物感受狀態(tài)。所用抗生素包括①氨基糖苷類：阿米卡星(AMK)，慶大霉素(GM)，卡那霉素(KM)，新霉素(NM)，鏈霉素(SM)；②氟喹諾酮類：環(huán)丙沙星(CPLX)，恩氟沙星(ENLX)，諾氟沙星(NFLX)；③β內(nèi)酰胺酶類：氨芐西林(ABPC)，阿莫西林(AMPC)；④其它：紅霉素(EM)，氯霉素(CP)，多西環(huán)素(DOXY)，多黏菌素B(PLMB)，利福平(RFP)，四環(huán)素(TC)，復(fù)方磺胺甲口惡唑(TMP/SMZ)等17種抗菌藥。(2)四環(huán)素耐藥基因的擴(kuò)增及檢測根據(jù)GenBank中的基因序列，并參照文獻(xiàn)［11］報(bào)道的序列設(shè)計(jì)引物tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetK和tetG(表1)，由北京奧科生物工程公司合成。細(xì)菌在含四環(huán)素(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，用培養(yǎng)物直接作PCR模板。反應(yīng)體系如下：模板(菌液)2μl，25μmol/L的上下游引物各1μl，10×PCR緩沖液(含MgCl2)5μl，4×dNTPs混合物2μl，TaqE 1μl，雙蒸水38μl，總體積50μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃ 1min，485～635℃ 1min，Δ℃為15℃，72℃ 1min 30s，共26個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)08%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測定， 并采用DNA Blast軟件， 將擴(kuò)增產(chǎn)物序列與已知序列進(jìn)行同源性比對分析。

表1 擴(kuò)增四環(huán)素耐藥基因所用引物序列（略）

F：為上游引物；R：為下游引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏實(shí)驗(yàn)測定藥敏紙片產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑，依據(jù)CLSI/NCCLS頒布的判定標(biāo)準(zhǔn)，記錄沙門菌對各種抗生素的耐藥性。結(jié)果表明，33株沙門菌均表現(xiàn)出多重耐藥性，對四環(huán)素的耐藥率為100%(表2)。

2.2 耐藥基因的擴(kuò)增用設(shè)計(jì)的7對引物對33株沙門菌進(jìn)行四環(huán)素耐藥基因擴(kuò)增，結(jié)果從29株細(xì)菌中擴(kuò)增出tetB產(chǎn)物，大約700bp，與欲擴(kuò)增的目的片段預(yù)測大小一致(圖1、圖2)。藥敏試驗(yàn)與tetB基因檢測的陽性符合率為879%(29/33)。4株tetB陰性的沙門菌血清型分別為：劍橋沙門菌、山夫登堡沙門菌、豬傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌。進(jìn)一步對tetB擴(kuò)增片段進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果顯示，參考菌大腸埃希菌ER2738的四環(huán)素耐藥基因與分離株的tetB的同源性為99%，與GenBank中的發(fā)表序列(登錄號：AF326777，AJ278685，AB089595)的同源性為99%，說明擴(kuò)增到的片段為tetB基因片段，且tetB為一較保守的基因。以質(zhì)粒pBR322(GenBank登錄號J01749)為陽性對照， 對tetC進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 雖然本研究從pBR322中成功擴(kuò)增出tetC基因的特異性片段，但所有沙門菌分離株均未擴(kuò)增出tetC特異條帶。用梯度PCR對tetA、tetD、tetE、tetG、tetK基因進(jìn)行擴(kuò)增，均未獲得特異性產(chǎn)物。

表2 豬源致病性沙門菌的多重耐藥性（略）

+：耐藥； -：敏感。

1：DNA Marker DL2000； 2：陰性對照； 3：陽性對照E.coli ER2738l； 4～25：臨床分離株：1#，2#，3#，4#，5#，6#，8#，9#，10#，11#，12#，15#，16#，17#，18#，19#，20#，21#，22#，23#，25#，26#

圖1 22株沙門菌tetB的PCR擴(kuò)增結(jié)果（略）

M：DNA Marker DL2000； 1：陰性對照； 2：陽性對照E.coliER2738l； 3～9：臨床分離株：27#，28#，29#，30#，31#，32#，33#

圖2 7株沙門菌tetB的PCR擴(kuò)增結(jié)果（略）

3 討論

對臨床分離的33株豬致病性沙門菌進(jìn)行藥敏分析，發(fā)現(xiàn)所有菌株均有多重耐藥性，表明豬源沙門菌的耐藥性相當(dāng)嚴(yán)重。因?yàn)檫@些分離株均來自臨床疑似沙門病的發(fā)病豬，臨床治療固然在這些沙門菌的耐藥性產(chǎn)生中起重要作用，但飼料抗生素添加劑的作用也不容忽視。沙門菌是導(dǎo)致人類食物中毒的主要細(xì)菌，在許多國家均位于食物中毒病原微生物之首［12，13］，加之豬肉在我國肉類總產(chǎn)量中占有約2/3的比例，所以豬源致病性沙門菌的嚴(yán)重多重耐藥性應(yīng)引起高度重視。四環(huán)素類為廣譜抗生素，通過結(jié)合在核糖體上，阻止氨基酰tRNA(aminoacyltRNA)與核糖體位置A結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，在醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)學(xué)上廣泛用于治療革蘭陰性菌、陽性菌感染及衣原體、支原體、立克次體與某些原蟲感染［14］。本研究中所檢測的沙門菌分離株100%對四環(huán)素具有耐藥性，可能與四環(huán)素的廣譜特性及大量使用有關(guān)。細(xì)菌產(chǎn)生四環(huán)素耐藥性的機(jī)制有多種，包括核糖體保護(hù)機(jī)制、藥物排出泵機(jī)制、酶鈍化機(jī)制等，由不同的四環(huán)素耐藥基因(tet)決定［9，14，15］。目前已經(jīng)鑒定了29種四環(huán)素耐藥基因及三種氧四環(huán)素(或土霉素)耐藥基因(otr)［14］。藥物導(dǎo)出泵機(jī)制是將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的四環(huán)素由導(dǎo)出泵排出細(xì)胞外，細(xì)菌表現(xiàn)出耐藥性。與藥物排出泵機(jī)制相關(guān)的耐藥基因包括：tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetI、tetJ、tetZ、tet30、tet31、tetK、tetL、otrB、tcr3、tetPA、tetV和tetY等［14］。核糖體保護(hù)機(jī)制通過耐藥基因編碼的核糖體保護(hù)蛋白(ribosomal protection protein，RPP)發(fā)揮作用。核糖體保護(hù)蛋白將四環(huán)素從核糖體上釋放出來，氨基酰tRNA可以與核糖體A位置結(jié)合，蛋白質(zhì)翻譯得以正常進(jìn)行［15］。與核糖體保護(hù)機(jī)制相關(guān)的耐藥基因有：tetM、tetO、tetS、tetW、tetQ、tetT、otrA、tetPB等［14］。與酶鈍化機(jī)制有關(guān)的耐藥基因有tetX。tetX編碼蛋白為一種氧化還原酶，通過化學(xué)修飾四環(huán)素使四環(huán)素失去活性［14，16］。四環(huán)素耐藥基因的分布存在多樣性，不同細(xì)菌、宿主種類及地理位置等都表現(xiàn)出四環(huán)素耐藥基因的差異［6］。一般認(rèn)為，革蘭陰性細(xì)菌的耐藥機(jī)制以抗生素的導(dǎo)出泵機(jī)制為主［17］，對豬體內(nèi)細(xì)菌及腸道菌而言，其決定導(dǎo)出泵的耐藥性基因以tetB為主［18，19］。本研究對豬源致病性沙門菌分離株的檢測結(jié)果與上述報(bào)道一致，33株細(xì)菌中有29株檢出tetB基因，測序鑒定其序列與參考序列的同源性99%。tetB檢測與藥敏實(shí)驗(yàn)的陽性符合率很高，達(dá)879%，說明tetB是決定沙門菌臨床分離株四環(huán)素耐藥性的主要基因。對耐藥沙門菌進(jìn)行SDS質(zhì)粒消除試驗(yàn)，可以使耐藥性消失，說明該四環(huán)素耐藥基因tetB存在于質(zhì)粒上(資料未顯示)。本研究未檢測出tetC基因，與代敏等報(bào)道tetC介導(dǎo)豬源致病性沙門菌的結(jié)論不一致［9］。由于本研究所用PCR能從陽性對照(pBR322)中成功擴(kuò)增出tetC，說明樣本中tetC的陰性檢測結(jié)果是可靠的。至于與相關(guān)報(bào)道的差異，可能與沙門菌分離株的宿主及地域來源不同有關(guān)。本研究的33株沙門菌來自于包括湖北地區(qū)在內(nèi)的七個(gè)省市，分別為：湖北(18株)，福建(4株)，河南(3株)，上海(3株)，浙江(3株)，山東(1株)，河北(1株)。除了tetB與tetC外，還對tetA、tetD、tetE、tetG和tetK等耐藥基因進(jìn)行了擴(kuò)增。為減少方法誤差，所有擴(kuò)增均采用梯度PCR。但是，除了tetB以外，所研究的耐藥分離株中未檢測到其它耐藥基因。有些沙門菌經(jīng)藥敏試驗(yàn)證明具有耐藥表型，但未能檢測到耐藥基因，這可能因?yàn)槠淠退幮杂善渌退幓驔Q定或存在其它耐藥機(jī)制。本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)含有耐藥基因但藥敏分析不表現(xiàn)耐藥性的現(xiàn)象，說明耐藥基因檢測是一種非常特異可靠的沙門菌四環(huán)素耐藥性監(jiān)測方法。由于四環(huán)素存在數(shù)十種耐藥基因，且基因分布多樣化，為了完全弄清我國沙門菌四環(huán)素耐藥基因的分布現(xiàn)狀及規(guī)律，還需進(jìn)行更廣泛的分子流行病學(xué)調(diào)查。

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