【摘要】 目的 研究多藥耐藥蛋白P糖蛋白(PGP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶π(GSTπ)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(TOPOⅡα)在初發(fā)急性白血病(AL)患者中的表達(dá)，并探討其與療效及預(yù)后之間的關(guān)系。方法 采用免疫組化SABC法檢測了PGP、MRP1、GSTπ、TOPOⅡα在30例AL患者白血病細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果 PGP、MRP1、GSTπ、TOPOⅡα在初發(fā)AL中表達(dá)的陽性率分別為23.33%、36.6%、60%和43.33%；PGP 、MRP1陽性組的完全緩解(CR)率均明顯低于陰性組(P<0.01)；TOPOⅡα陽性組的CR率為92.31%，高于陰性組的58.82%(P<0.05)；GSTπ陽性組的CR率與陰性組的CR率之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 單一PGP、MRP1的表達(dá)升高及TOPOⅡα的表達(dá)降低與AL的治療反應(yīng)差、預(yù)后不良有明顯的相關(guān)性；聯(lián)合多個多藥耐藥蛋白能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測AL的耐藥和預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】 急性白血病；多藥耐藥；療效；預(yù)后

Relationship between ectopic expression of multidrugresistancerelated proteins and clinical efficacyand prognosis in acute leukemia

ABSTRACT: Objective To study the expression of multidrug resistancerelated protein PGP， MRP1， GSTπ and TOPOⅡα in de novo acute leukemia(AL) and explore the relationship between its expression and chemotherapy efficacy and prognosis. Methods The expression of PGP， MRP1， GSTπ and TOPOⅡα was detected by SABC method of immunohistochemistry in leukemia cells of 30 de novo patients. Results The positive rate of PGP， MRP1， GSTπ and TOPOⅡα was 23.33%， 36.6%， 60% and 43.33% in de novo AL， respectively. The complete remission (CR) rate in PGP or MRP1 positive group was obviously lower than that in PGP or MRP1 negative group(P<0.01). The CR rate of TOPOⅡα positive group (92.31% ) is higher than TOPOⅡα negative group (58.82%， P<0.05). There was no significant difference between GSTπ positive group and GSTπ negative group (P>0.05). Conclusion Single overexpression of PGP and MRP1 or single decreased expression of TOPOⅡα is strongly related to poor chemotherapy efficacy and poor prognosis in AL. Combining more than one multidrug resistancerelated proteins can predict the drug resistance and chemotherapy efficacy more accurately in AL.

KEY WORDS: acute Leukemia (AL); multidrug resistance (MDR); chemotherapy efficacy; prognosis

多藥耐藥(multidrug resistance， MDR)是導(dǎo)致白血病化療失敗的最主要的原因之一，也是徹底治愈白血病的最大障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白P糖蛋白(Pglycoprotein， PGP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistanceassociated protein 1， MRP1)、細(xì)胞漿內(nèi)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶π(glutathioneStransferaseπ， GSTπ)、細(xì)胞核內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(topoisomeraseⅡα， TOPOⅡα)的表達(dá)異常以及抗凋亡因子Bcl2、survivin等的表達(dá)增高均與多藥耐藥有關(guān)[12]。在本研究中，我們采用免疫組化SABC法檢測了30例初發(fā)急性白血病(acute leukemia， AL)患者骨髓白血病細(xì)胞中PGP、MRP1、GSTπ、TOPOⅡα的表達(dá)情況，探討不同蛋白表達(dá)與初發(fā)AL的療效、預(yù)后間的關(guān)系及其對化療的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 初發(fā)AL患者30例，男性16例，女性14例，中位數(shù)年齡37.5歲。全部病例均經(jīng)FAB分型，部分病例結(jié)合免疫分型。其中，急性髓細(xì)胞性白血病(AML)26例，急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)3例，急性混合細(xì)胞性白血病1例。初發(fā)AML患者采用DA、HA、MA(D：柔紅霉素；H：高三尖杉酯堿；M：米托蒽醌；A：阿糖胞苷)為主的化療方案；初發(fā)ALL患者采用VCDLP(長春新堿、環(huán)磷酰胺、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、潑尼松)為主的化療方案。耐藥評定是經(jīng) 2個上述標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療后骨髓未達(dá)完全緩解的病例。

1.2 方法

1.2.1 單個核細(xì)胞的制備 抽取骨髓3mL，置于肝素抗凝管中，加生理鹽水2mL，緩慢注入含有5mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的離心管上層，1800r/min離心20min，吸取單個核細(xì)胞，生理鹽水洗滌2次后棄上清，40g/L多聚甲醛懸液固定30min后，配成細(xì)胞懸液制作成滴片。

1.2.2 PGP、MRP1、GSTπ、TOPOⅡα的檢測 采用免疫組化SABC法。PGP采用鼠抗人單克隆抗體(MDRAb2，CLONE F4，Neu Makers公司)，TOPOⅡα采用鼠抗人單克隆抗體(JH2.7，北京中山生物技術(shù)有限公司)，MRP1用兔抗人單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，GSTπ采用兔抗人多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。免疫組化SABC試劑盒購自IMMUNOTECH公司，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.2.3 免疫組化陽性結(jié)果的判斷[3] PGP陽性者細(xì)胞膜或細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色；MRP1陽性者胞漿中散在黃色或棕黃色顆粒，胞膜呈黃色或棕黃色；GSTπ陽性為細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色，有散在黃色或棕黃色細(xì)小顆粒。PGP、MRP1、GSTπ陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性。TOPOⅡ陽性者胞核呈黃色或棕黃色，陽性細(xì)胞數(shù)≥20%為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理，采用確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四種耐藥蛋白的表達(dá)及其與療效和預(yù)后的關(guān)系 PGP、MRP1、GSTπ、TOPOⅡα在初發(fā)AL患者中表達(dá)的陽性率分別為23.33%、36.6%、60%和43.33%(圖1)。PGP陽性患者的完全緩解(CR)率為28.57%(2/7)，明顯高于PGP陰性患者的86.96%(20/23)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；MRP1陽性患者的CR率為36.36%(4/11)，明顯低于陰性患者的94.74%(18/19)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；GSTπ陽性患者的CR率為61.11%(11/18)，陰性患者的CR率為91.67%(11/12)，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TOPOⅡα陽性患者的CR率為92.31%(12/13)，明顯高于陰性患者的58.82%(10/17)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 PGP、MRP1、GSTπ、TOPOⅡα的免疫組化染色（略）

Fig.1 Immunohistochemistry stain result of PGP， MRP1， GSTπ， TOPOⅡα ×1000

A， B: PGP， MRP1 positive， the memberane and cytosol of positive cells is stained with brownyellow; C: GSTπ positive， the cytosol of positive cells is stained with brown; D: TOPOⅡα negative， the nucleus of positive cells is stained with brown

2.2 四種中至少有兩項表達(dá)異常與療效及預(yù)后的關(guān)系 PGP、MRP1、GSTπ和TOPOⅡα中至少有兩項指標(biāo)表達(dá)異常(PGP、MRP1、GSTπ為表達(dá)陽性，TOPOⅡα為表達(dá)陰性)患者的CR率為38.46%(5/13)，而PGP、MRP、GST均表達(dá)陰性伴TOPOⅡα表達(dá)陽性患者共11例均達(dá)到CR。PGP、MRP1、GSTπ和TOPOⅡα中至少有兩項指標(biāo)表達(dá)異常組的CR率明顯低于均表達(dá)正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 PGP、MRP1、GSTπ均表達(dá)陽性伴TOPOⅡα表達(dá)陰性與療效及預(yù)后的關(guān)系 PGP、MRP、GST表達(dá)陽性伴TOPOⅡα表達(dá)陰性的患者有3例。其中，1例M1患者3個療程達(dá)到CR，但3月內(nèi)又復(fù)發(fā)，1年內(nèi)死亡；1例M2患者從未達(dá)到CR，5月內(nèi)死亡；1例M3從未達(dá)到CR，半年內(nèi)死亡。這3例患者臨床都對化療不敏感，預(yù)后極差。而PGP、MRP、GST均表達(dá)陰性伴TOPOⅡα表達(dá)陽性患者共11例，均達(dá)到CR，預(yù)后良好。

3 討論

多藥耐藥是指白血病細(xì)胞對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理完全不同的多種化療藥物同時產(chǎn)生耐藥性，是導(dǎo)致白血病化療失敗的主要原因。PGP是最早發(fā)現(xiàn)的與多藥耐藥有關(guān)的蛋白，是一種細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運蛋白，可將化療藥物主動轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)與靶點結(jié)合的藥物濃度降低，不能起到有效地殺傷瘤細(xì)胞作用，從而產(chǎn)生耐藥。大量研究發(fā)現(xiàn)，PGP表達(dá)陽性患者對誘導(dǎo)緩解化療反應(yīng)以及生存期都較PGP表達(dá)陰性患者的差[45]。并且PGP在難治性、復(fù)發(fā)性白血病患者中的表達(dá)明顯高于初發(fā)組患者，說明PGP表達(dá)與白血病的預(yù)后不良有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)PGP表達(dá)陽性患者組的完全緩解率明顯低于陰性患者組，顯示PGP表達(dá)陽性患者對誘導(dǎo)緩解化療反應(yīng)差，表明PGP表達(dá)與初治白血病療效之間確實存在著一定的相關(guān)性。因此，PGP可作為分析判斷初治白血病療效及預(yù)后的重要指標(biāo)之一。MRP1是繼PGP之后發(fā)現(xiàn)的又一與耐藥相關(guān)的膜表面糖蛋白，耐藥機(jī)理與PGP相似，通過降低細(xì)胞內(nèi)藥物積聚或改變藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布產(chǎn)生耐藥[6]。有研究發(fā)現(xiàn)MRP1基因表達(dá)升高及蛋白表達(dá)陽性患者的療效和預(yù)后都較MRP1基因表達(dá)降低及蛋白表達(dá)陰性患者差，提示MRP1表達(dá)與白血病的療效及預(yù)后有關(guān)[4，7]。本研究結(jié)果顯示，MRP1陽性患者組的CR率為36.36%，明顯低于 MRP1陰性患者組的94.74%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明MRP1的表達(dá)的確與白血病的臨床療效存在一定的相關(guān)性，MRP1的表達(dá)與否也是預(yù)測白血病耐藥和預(yù)后的重要指標(biāo)之一。GSTπ是人體內(nèi)重要的解毒酶，能催化親電子類化療藥物與還原型谷胱甘肽結(jié)合，形成一種硫醚連接的還原型谷胱甘肽結(jié)合物(GS結(jié)合物)，使藥物毒性減低，水溶性增加，利于排出，從而產(chǎn)生耐藥。其耐藥作用已在多種實體瘤中得到證實，但與白血病耐藥中的關(guān)系仍待進(jìn)一步闡明。有研究發(fā)現(xiàn)GSTπ表達(dá)陽性白血病患者的臨床療效和預(yù)后差[8]，但也有研究顯示GSTπ表達(dá)陽性與白血病的療效和預(yù)后無關(guān)[9]。本文通過對30例急性白血病患者的研究發(fā)現(xiàn)，盡管GSTπ陽性患者組的CR率低于GSTπ陰性患者組，但兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明GSTπ的表達(dá)與白血病的療效和預(yù)后無相關(guān)性，不能單獨用于預(yù)測白血病的耐藥和預(yù)后。TOPOⅡα是真核細(xì)胞內(nèi)重要的核酸酶，具有DNA內(nèi)切酶和連接酶功能，介導(dǎo)DNA雙鏈的斷裂與重接反應(yīng)。TOPOⅡα也是許多白血病化療藥物作用的靶點，其表達(dá)降低就會使化療藥物作用的靶點減少，形成的可斷裂復(fù)合物減少，以及造成的細(xì)胞損傷減弱，從而表現(xiàn)為耐藥。顧靜文等[3]發(fā)現(xiàn)， TOPOⅡα表達(dá)的降低與白血病耐藥的產(chǎn)生有關(guān)。本研究亦顯示，TOPOⅡα陽性患者組的CR率為92.31%，明顯高于表達(dá)陰性患者組的58.82%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明TOPOⅡα的表達(dá)降低也是導(dǎo)致白血病療效差及預(yù)后不良的因素之一。本研究通過對單一多藥耐藥蛋白表達(dá)及多重耐藥蛋白表達(dá)與白血病療效及預(yù)后關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)雖然單一PGP、MRP1的表達(dá)增高或TOPOⅡα的表達(dá)降低能夠預(yù)測白血病的臨床療效和預(yù)后，但仍然有PGP和MRP1表達(dá)陰性的患者表現(xiàn)為多藥耐藥。說明只靠單一多藥耐藥蛋白的表達(dá)來預(yù)測療效及預(yù)后會造成一定的偏差。通過聯(lián)合多個耐藥蛋白與白血病療效及預(yù)后關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)多種多藥耐藥蛋白表達(dá)綜合分析能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測急性白血病的耐藥和預(yù)后，指導(dǎo)白血病的合理用藥及治療，使患者達(dá)到最佳治療效果。