【關鍵詞】 Survivin反義核酸；卵巢腫瘤；凋亡；多西他賽；多藥耐藥基因

Experimental study on apoptosis of ovarian cancer cells and reversal docetaxel drug resistance induced by Survivin antisense RNA

【Abstract】 AIM: To establish Survivin antisense RNA and explore its effect on the apoptosis of ovarian cancer cells and the sensitivity to docetaxel and its mechanism of reversing docetaxel drug resistance. METHODS: Survivin antisense eukaryotic vector (antipcDNA3svv) was transferred into Skov3 cells by electroporation and positive clone was screened out. Survivin protein was detected by Western blot; effect of apoptosis inducement was observed by flow cytometry; sensitivity to docetaxel was examined by MTT; expression of MDR1 mRNA was detected. RESULTS: Survivin protein of positively cloned cells were reduced obviously as compared with that of nontransfered cells. Terminal apoptotic change was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was 19%; IC50 of experimental group to docetaxel was （13.3±2.25） ng/mL and control group was (53.2±2.45) ng/mL， so the statistical difference was significant (P<0.01). Expression of MDR1 mRNA of Skov3SVVanti group was reduced obviously as compared with that of Skov3 group (P<0.01). CONCLUSION: Survivin antisense RNA can induce ovarian cancer cell apoptosis and increase the sensitivity to docetaxel by reducing the expression of MDR1 mRNA.

【Keywords】 survivin antisense RNA; ovarian neoplasms; apoptosis; docetaxel; MDR1

【摘要】 目的: 構建Survivin反義真核表達載體（antipcDNA3svv），探討其對卵巢癌的凋亡誘導作用、對多西他賽的化療增敏作用及逆轉耐藥的機制. 方法：采用Survivin反義核酸瞬時電轉染法轉染卵巢癌細胞系Skov3， 篩選出陽性細胞株. 以Western blot檢測Survivin蛋白的表達，用流式細胞儀檢測其對Skov3的凋亡誘導作用，采用MTT法檢測其對多西他賽的化療增敏作用，并檢測實驗組細胞（Skov3SVVanti）MDR1 mRNA的表達. 結果：穩定表達antipcDNA3svv的Skov3SVVanti其Survivin蛋白表達比未轉染者明顯降低，Skov3SVVanti組細胞流式細胞儀檢測顯示其凋亡率為19%，對多西他賽的IC50值為（13.3±2.25）ng/mL，而對照組（Skov3）為(53.2±2.45) ng/mL，差異具有明顯的統計學意義(P<0.01). Skov3SVVanti組MDR1 mRNA表達較Skov3組明顯減少（P<0.01）. 結論：Survivin反義核酸可誘導卵巢癌細胞凋亡，并通過降低MDR1 mRNA表達增強多西他賽化療敏感性.

【關鍵詞】 Survivin反義核酸；卵巢腫瘤；凋亡；多西他賽；多藥耐藥基因

0引言

上皮性卵巢癌是常見的婦科腫瘤，具有易轉移及復發的特性，因此手術后化療是卵巢癌規范化治療最重要的內容之一. 多西他賽（docetaxel）又名泰索帝是治療卵巢癌的新藥，其聯合鉑類治療卵巢癌臨床緩解率遠高于鉑類聯合其他化療藥. 但是對于一些復發和多處轉移的患者，多西他賽也產生了耐藥現象. Survivin是新近發現的IAP(inhibitor of apoptosis protein)家族成員，能抑制caspase 活性而發揮抗凋亡作用. 已有研究證實［1］，Survivin基因的高表達與化療耐藥有密切關系，抑制Survivin基因的表達能增加腫瘤組織對化療的敏感性，對于維持正常細胞生物學特性具有重要作用［2］. 本研究旨在研究應用反義策略阻斷Survivin表達，對誘導卵巢癌細胞凋亡及提高卵巢癌細胞多西他賽敏感性的作用，并進一步探討其逆轉耐藥的機制.

1材料和方法

1.1細胞株和細胞培養人卵巢癌細胞株Skov3由哈爾濱醫科大學腫瘤研究所惠贈. 用含有100 mL/L胎牛血清（Gibco公司）的RPMI 1640（Gibco公司）培養（37℃，50 mL/L CO2）. 順鉑（F.H.Faulding & Co Ltd公司）及多西他賽（Aventis Pharma， Dagenham公司）溶解于DMSO(Gibco公司)，4℃保存.

1.2Survivin反義真核表達載體（antipcDNA3svv）的構建Survivin基因通過RTPCR方法克隆獲得. 應用Trizol（Takara公司）法從卵巢癌細胞株Skov3中抽提總RNA，正向引物為5′atattctagaccatgggtgccccgacgttgc3′，反向引物5′aatcgaattctcaat ccatggcagccagctg3′. PCR擴增條件為：94℃預變性2 min，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共30循環，72℃延伸10 min，擴增產物用瓊脂糖回收試劑盒回收提純后，擴增產物進行末端連接腺嘌呤（A）反應，與帶有胸腺嘧啶末端（T）的載體pcDNA3.1(Invitrogen公司，DNA3.1/CTGFPTOPO)連接. 重組體轉化感受態大腸桿菌DH5α，篩選Amp陽性克隆者小量抽提質粒（質粒抽提試劑盒Takara公司），送去測序（上海生工公司）. 經測序，選出其中反向連接者，命名為antipcDNA3svv.

1.3電轉染Skov3細胞及陽性克隆的篩選收集6×106細胞于預冷的0.2 cm電轉杯中，加入antipcDNA3svv 15 μL，終體積800 μL， 300 V電壓電穿孔14.4 ms，48 h后傳代培養，加入含有G418的培養基篩選陽性克隆，濃度由200 mg/L漸加至800 mg/L，共篩選42 d，可見有抗性細胞生長，命名為Skov3SVVanti. 上述同樣條件空質粒pcDNA3.1轉染Skov3，篩選出陽性克隆命名為Skov3neo. 分為3組：Skov3SVVanti組（實驗組）、Skov3neo組（空質粒組）及Skov3組（空白對照組）.

1.4轉染細胞Survivin蛋白表達的檢測將3組細胞培養48 h，PBS漂洗3次后加入4℃的50 μL裂解液，冰浴20 min，12 000 g/min離心后取上清液. Bradford法測定蛋白濃度. 取每種樣品各40 μg，100 g/L SDS PAGE凝膠電泳分離，通過點轉移法將蛋白質從SDS PAGE凝膠轉移至硝酸纖維素膜后在含有50 g/L脫脂奶粉的TTBS中37℃封閉90 min，加入1∶1000羊抗人Survivin（上海中山公司），4℃過夜，TTBS充分漂洗后加入1∶4000兔抗羊lgG/HRP（上海中山公司），室溫孵育1 h，TTBS充分漂洗，洗膜后加入LumiGLO化學發光試劑作用1 min. X線暗室曝光，常規顯影定影. 同樣實驗條件重復4次. 圖像以Bio Rad圖像分析系統分析，用蛋白條帶的平均光強度值表示Survivin表達的相對強度.

1.5流式細胞儀觀察腫瘤細胞凋亡細胞傳代培養48 h后，收集10×106個細胞，分成10個樣本，每個樣本1×106個細胞. 用700 mL/L的乙醇0℃固定，過夜，PBS洗滌并重懸細胞，加入PI染液1 mL（EB 10 μg，PI 50 μg， RNaseⅠ酶10 μg， 枸櫞酸鈉5 mg， TritonX100為0.4 μL，加生理鹽水至1 mL），室溫下孵育30 min，流式細胞儀檢測. 觀察亞二倍體峰的變化. 凋亡率采用上述樣本的均值. 結果以lysisⅡ軟件分析.

1.6Skov3SVVanti細胞對多西他賽敏感性分析（MTT）備96孔板，每孔加入100 μL的1×105的Skov3，Skov3neo，Skov3SVVanti細胞，每種細胞加7孔，其中1孔做調零用，每孔依次加入0，1，10，20，50，100 (μg/L)多西他賽， 37℃培養48 h后，每孔加入MTT（10 g/L） 10 μL，培養4 h，棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞楓（DMSO），振蕩10 min，酶標儀測定490 nm處吸光度（A）值. 根據A值計算細胞存活率并計算細胞生長抑制50%的多西他賽濃度，即IC50值. 記錄加多西他賽50 μg/L后0，24，48，72 h細胞生長曲線. 上述實驗重復三次，取均值. 三組間IC50比較采用采用方差分析進行.

1.7反義Survivin核酸對MDR1 mRNA表達的影響上述3組細胞利用Trizol(Takara公司)法提取總RNA，RTPCR法擴增MDR1 mRNA，進行比較. MDR1的上、下游引物分別為為：5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′；5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′，擴增片段412 bp. 以βactin為內參照（上、下游引物分別為：5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′；5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′，擴增片段127 bp）. 擴增產物用20 g/L瓊脂糖電泳，根據條帶亮度的不同進行分析. MDR指數：MDR值/βactin值. 三組間MDR指數比較采用方差分析.

2結果

2.1重組質粒的構建和鑒定利用RTPCR方法從Skov3細胞克隆出Survivin基因，全長451 bp，經電泳證實擴增片段與預先設計片段大小一致. 與載體pcDNA3.1以AT策略連接后轉化感受態大腸桿菌，挑取陽性克隆酶切鑒定，再經上海生工公司測序與基因庫中序列完全符合（圖1），選取其中與pcDNA3.1反向連接者命名為antipcDNA3svv. 由此得到真核表達載體.

2.2轉染后穩定表達反義Survivin細胞克隆的獲取陰性轉染細胞在G418 800 mg/L濃度時死亡，陽性轉染細胞漸形成單細胞克隆Skov3SVVanti（圖2）. 采用胰酶定點消化的方法，將單細胞克隆洗脫到25 mL細胞培養瓶，進行傳代培養，培養成含有antipcDNA3svv的細胞株.

2.3轉染antipcDNA3svv對Skov3中Survivin蛋白表達的影響Western blot印跡法顯示Skov3SVVanti組Survivin蛋白表達較Skov3neo組和Skov3組明顯降低，應用計算機對條帶凈密度進行分析Skov3SVVanti組Survivin蛋白的表達僅為Skov3neo組的29.1%，為Skov3組23.7%. 2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率轉染antipcDNA3svv組Skov3細胞亞二倍體峰較轉染空質粒組和未轉染組都明顯為高，10個樣本平均凋亡率達到19%，而轉染空質粒組及未轉染組均為2%（圖3）.

2.5antipcDNA3svv增加Skov3對多西他賽敏感性的檢測各組細胞隨著多西他賽藥物濃度的提高，細胞存活率都呈下降趨勢，但antipcDNA3svv組下降更加明顯(表1)，其IC50值為（13.3±2.25） μg/L，而Skov3neo組和Skov3組分別為(48.7±1.12) μg/L和(53.2±2.45) μg/L，與Skov3neo組和Skov3組相比，Skov3SVVanti組的IC50值明顯下降，差異具有顯著性（P<0.01）. 在多西他賽藥物濃度為50 μg/L，Skov3SVVanti組細胞存活率也較其他兩組明顯下降（圖4）.表1不同藥物濃度細胞生存率(略)

2.6各組細胞MDR1 mRNA的表達分別從Skov3，Skov3neo，Skov3SVVanti細胞中提取MDR1 mRNA，發現轉染antipcDNA3svv的Skov3SVVanti其MDR1 mRNA表達較其他兩組明顯降低，而不影響βactin的表達，轉染空質粒組比對照組MDR1 mRNA表達亦有下降. 各組MDR指數分別為：0.196±0.013(Skov3SVVanti組)，3.126±0.019（Skov3組），2.958±0.024（Skov3neo組）. 經方差分析， Skov3SVVanti與Skov3neo，Skov3細胞的MDR1 mRNA表達量之間存在差異性（P<0.01）.

3討論

Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族的新成員，其表達產物具有獨特的結構，能夠保護特定的細胞抵抗一系列刺激原誘導，具有凋亡抑制、血管保護、調節細胞周期等多種生物學活性. Survivin特異性的表達于胚胎和發育的胎兒組織中，在成人終末分化組織無表達，而在各種腫瘤組織如肺小細胞肺癌、胃癌中則有廣泛表達［3-4］. Survivin獨特的組織分布使得抑制Survivin蛋白的表達不會對機體產生較大的影響，使其成為腫瘤反義治療理想的靶基因.

細胞凋亡通路的異常在惡性腫瘤中很常見，凋亡異常使得細胞逃脫正常的監控機制，從而發生細胞分裂的異常以及對放療、化療的耐受. 生存素的高表達可能使得卵巢癌細胞更容易逃避G0/G1期和G2/M期的分子檢查機制而不發生細胞凋亡. 本研究中成功構建了反義真核表達載體antipcDNA3svv，轉染入Skov3細胞，并且篩選出穩定表達antipcDNA3svv的細胞株. 通過Western blot證實穩定表達antipcDNA3svv的實驗組其生存蛋白表達明顯下降. 在流式細胞儀的檢測中實驗組可見到一個明顯的亞二倍體峰（凋亡峰），而在轉染空質粒組則沒有，實驗組的細胞凋亡率是空質粒組的8.5倍，說明轉染antipcDNA3svv的細胞株其凋亡率明顯升高. 上述結果表明本實驗所構建的antipcDNA3svv轉染Skov3細胞后對Survivin蛋白的阻斷及對腫瘤細胞的凋亡誘導作用是確切的.

在實性腫瘤中，生存素的過度表達與腫瘤對化療藥物的耐藥性有關［5］. 化療耐藥性的產生是影響療效的關鍵因素，腫瘤細胞凋亡機制的缺陷是耐藥性產生的關鍵因素之一，對細胞凋亡機制的修復可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，克服耐藥性的產生. 多西他賽又名泰索帝，是新發現的多西紫杉醇，藥物作用機制與紫杉醇一致，在GTP不足的情況下，誘導β微管蛋白的廣泛聚合，使微管積集成束，非常穩定，從而發揮其殺腫瘤作用. 本研究中發現實驗組生存素蛋白表達明顯下降，對多西他賽的敏感性明顯上升，其IC50值為約13 μg/L，而空質粒組和空白對照組分別約為48 μg/L和52 μg/L，具有明顯的統計學意義. 在多西他賽藥物濃度為50 μg/L，從藥物作用6 h起，實驗組就與對照組顯示出明顯的生存差異，實驗組細胞生存率明顯下降. Muenchen等［6］研究證實Survivin的表達阻斷了PC3細胞中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶Caspase3和Caspase7的活性，同時保護腫瘤細胞不受抗腫瘤藥物如多西他賽的影響. 有研究顯示穩定轉染野生型Survivin的卵巢癌細胞對多西他賽的抗藥性是對照組的6倍［7］. 本研究中穩定轉染反義Survivin的卵巢癌細胞對多西他賽的敏感性是轉染空質粒組3.7倍，是未轉染組的4倍，實驗結果表明抑制生存素的表達對增加卵巢癌對多西他賽的敏感性起著至關重要的作用. 實驗結果并提示實驗組對多西他賽化療敏感性的增加有可能與MDR基因表達的下降有關.

綜上所述，我們在體外實驗中證實了抑制生存素可以誘導卵巢癌細胞的凋亡，并且增加卵巢癌細胞對多西他賽的敏感性，通過抑制生存素的表達及聯合化療藥物的應用可能會使卵巢癌在不久的將來得到更為有效的治療，為反義生存素的臨床應用提供新的思路.

［1］Chandele A，Prasad V，Jagtap JC，et al. Upregulation of Survivin in G2/M cells and inhibition of caspase 9 activity enhances resistance in staurosporineinduced apoptosis［J］. Neoplasia， 2004，6(1):29-40.

［2］甄海寧，章翔，王西玲，等. Survivin在2株人腦膠質瘤細胞系中的表達［J］. 第四軍醫大學學報，2005，26（1）：57-58.

［3］Falleni M， Pellegrini C， Marchetti A，et al. Survivin gene expression in earlystage nonsmall cell lung cancer［J］. J Pathol， 2003，200(5):620-626.

［4］姚學權，劉福坤，祁曉萍，等. 胃腺癌組織Survivin基因的表達與細胞增殖及凋亡的相關性研究［J］.中華外科雜志， 2004，42(3):145-148.

［5］Shah MA. Recent developments in the treatment of gastric carcinoma［J］. Curr Oncol Rep，2002， 4: 193-201.

［6］Muenchen HJ， Poncza PJ， Pienta KJ. Different docetaxelinduced apoptotic pathways are present in prostate cancer cell lines LNCaP andPC3［J］. Urology， 2001，57(2):366-370.

［7］Lens SM， Wolthuis RM， Klompmaker R， et al. Survivin is required for a sustained spindle checkpoint arrest in response to lack of tension［J］. EMBO J，2003，22(12):2934-2947.