作者：袁鵬，黃艷紅，辛曉燕，宋暉，田爽，王德堂

【關鍵詞】 染料

bined with cisplatin on drugresistant ovarian carcinoma cell SKOV3

【Abstract】 AIM: To investigate the effects of genistein combined with cisplatin on the proliferation and apoptosis of drugresistant ovarian carcinoma cell SKOV3. METHODS: The growth inhibitory effect of genistein and cisplatin on SKOV3 cells was studied by MTT growth assay， the morphological alterations of SKOV3 cells were demonstrated by Hoechst 33342 staining under a fluorescence microscope and apoptosis and cell cycle distribution were detected by flow cytometry. RESULTS: Various concentrations of genistein in combination with cisplatin resulted in the reduction of IC50 by 32.3%-79.8% in SKOV3 cells. The combination index of genistein and cisplatin in SKOV3 cells ranged from 0.586 to 0.869， which indicated that they acted in a slightly to highly synergistic pattern. The apoptotic rate was also significantly raised by combination of genistein and cisplatin， which showed a relationship with G2/M arrest and the disturbance of S phase because there was a negative correlation between apoptotic rate and G1 phase cell fraction（rs=-0.953， P<0.05）. CONCLUSION: Genistein can significantly improve the growth inhibition and cytotoxicity effects of cisplatin on SKOV3 cells and the two agents act in a synergistic way. These synergistic effects may be related to the G2/M arrest and the disturbance of S phase by genistein.

【Keywords】 genistein; cisplatin; ovarian neoplasms; drug synergism

【摘要】 目的：探討染料木黃酮與順鉑聯用對耐藥卵巢癌細胞系SKOV3增殖與凋亡的影響. 方法：采用MTT比色法檢測染料木黃酮和順鉑聯用對SKOV3細胞增殖的影響，Hoechst染色熒光顯微鏡下觀察聯合用藥后細胞形態的改變，流式細胞儀分析細胞周期并檢測凋亡率. 結果：聯用不同濃度的染料木黃酮后順鉑對SKOV3細胞IC50降低率為32.3%~79.8%，兩藥聯合作用系數在0.586~0.869之間，為輕度至高度協同作用. 染料木黃酮與順鉑聯用可顯著提高凋亡率，兩藥聯用誘導SKOV3細胞凋亡和阻滯G2/M期、干擾S期進程，凋亡率與G1期細胞比例呈負相關（rs=-0.953， P<0.05）. 結論: 染料木黃酮可以增強順鉑對SKOV3細胞的增殖抑制作用和殺傷作用，兩種藥物具有協同作用. 染料木黃酮阻滯細胞于G2/M期并同時干擾S期進程可能是兩藥發揮協同作用的重要機制.

【關鍵詞】 染料木黃酮；順鉑；卵巢腫瘤；藥物協同作用

0引言

近年來染料木黃酮（4，5，7三羥基異黃酮，genistein）對腫瘤生長的抑制作用日益受到重視，尤其是它可以增強常規化療藥物的療效［1-2］. 而染料木黃酮和傳統化療藥物順鉑聯用能否增強順鉑對耐藥卵巢癌的殺傷作用呢？為此，我們研究了染料木黃酮與順鉑聯用對耐藥卵巢癌SKOV3細胞增殖與凋亡的影響及其機制.

1材料和方法

1.1材料

人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞系SKOV3由西京醫院婦產科實驗室保存，該細胞系對順鉑等多種藥物耐藥；RPMI 1640培養基(Gibco公司)；新生牛血清(四季青公司)；順鉑(齊魯制藥廠)；染料木黃酮、二甲基亞砜（DMSO），Hoechst33342(Sigma公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(Amresco公司). 細胞周期檢測試劑盒為DNAPrep Stain kit(BeckmanCoulter公司)；Wellscan MK3型全自動酶標儀(Labsystems Dragon公司)；ELITE ESP型流式細胞儀（BeckmanCoulter公司）.

1.2方法

1.2.1MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數生長期的SKOV3細胞，8×103個/孔接種于96孔培養板，置37℃，50 mL/L CO2培養箱培養12 h，細胞貼壁后棄去培養液，然后加入含不同濃度藥物的培養基200 μL：對照組只加RPMI 1640培養基(100 mL/L小牛血清)；順鉑組加入順鉑濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10，20 mg/L的培養基；染料木黃酮組加入染料木黃酮濃度分別為2.5，5，10，20，30，40，50 mg/L的培養基；染料木黃酮和順鉑聯用組為2.5，5，10，20 mg/L的染料木黃酮與順鉑聯用，順鉑濃度同單藥組，每組均設6個復孔. 繼續培養至加藥后96 h，每孔加入MTT(5 g/L，20 μL)，繼續孵育4 h后棄培養液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶標儀檢測各孔吸光值(A490 nm)，按以下公式計算：細胞增殖抑制率=（對照組A490 nm-實驗組A490 nm）/對照組A490 nm×100%，取6復孔均值繪制抑制率與藥物劑量關系曲線，按作圖法求出半數抑制濃度（IC50）. 同時采用聯合作用指數(combined index，CI)判斷染料木黃酮和順鉑聯用的性質. CI=DA／ICX，A+DB／ICX，B (A，B代表兩種不同藥物，ICX，A和ICX，B是兩種藥物單獨使用使生長抑制率達X時的藥物濃度，DA和DB是兩藥聯用使生長抑制率達X時兩種藥物的濃度)［3］. 根據Soriano等［4］的判斷方法，0.9≤CI≤1.1為疊加作用，0.8≤CI<0.9為低度協同作用，0.6≤CI<0.8為中度協同作用，0.4≤CI<0.6為高度協同作用，0.2≤CI<0.4為強協同作用.

1.2.2熒光染色觀察細胞形態的改變接種SKOV3細胞于蓋玻片，置于六孔板內，細胞貼壁后加入不同藥物，根據MTT結果分為4組：即對照，順鉑（2.5 mg/L），染料木黃酮（10 mg/L）和染料木黃酮（10 mg/L）+順鉑（2.5 mg/L）. 繼續培養36 h，固定后加入0.5 mL Hoechst33342（10 mg/L），染色15 min后棄染液清洗，抗熒光淬滅液封片，紫外光激發，在熒光顯微鏡下觀察.

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的變化收集SKOV3細胞，調整細胞密度為5×107/L，以每瓶8 mL接種于75 mL培養瓶，細胞貼壁后棄去培養液，加入含不同濃度藥物的培養基. 根據MTT結果，順鉑濃度選2.5 mg/L， 染料木黃酮濃度選5和10 mg/L，設對照、單藥和聯用共6組. 加藥36 h后收集細胞，分別按DNAPrep Stain Kit試劑盒和Apoptosis Detection Kit試劑盒說明書進行細胞固定、染色，上流式細胞儀分析.

統計學處理： SPSS 11.0軟件進行秩相關分析.

2結果

2.1染料木黃酮與順鉑聯用對SKOV3細胞增殖的影響染料木黃酮、順鉑單藥的IC50分別為30.0 mg/L和9.9 mg/L，4種不同濃度的染料木黃酮與順鉑聯用后順鉑的IC50明顯降低，與單用順鉑組比較，4種不同濃度的染料木黃酮可使順鉑的IC50分別降低到6.7，4.2，2.5和2.0 mg/L（圖1）. 當達到半數抑制時，不同濃度組合的染料木黃酮與順鉑的CI分別為0.760，0.591，0.586，0.869. 其中10和5 mg/L染料木黃酮與順鉑聯用達到高度協同作用；20.0 mg/L和2.5 mg/L染料木黃酮與順鉑聯用分別達到低、中度協同作用.

2.2染料木黃酮與順鉑聯用后SKOV3細胞形態的改變對照組細胞核均勻淡染，界限清楚，呈正常結構(圖2A)；順鉑組與對照組無明顯差異(圖2B)；染料木黃酮組可見少量凋亡細胞(圖2C)；聯用組出現大量典型的凋亡細胞：細胞核染色明顯增強，熒光更為明亮，強度深淺不一，并可見濃染致密的染色質凝集，呈顆粒狀、固縮狀或團塊狀結構（圖2D）.

2.3染料木黃酮、順鉑單藥及聯用對SKOV3細胞周期及細胞凋亡的影響對照組絕大多數細胞處于DNA合成前期，G1期細胞比例高，S期和G2期細胞較少，凋亡率很低；2.5 mg/L順鉑組對SKOV3細胞周期和凋亡率無明顯影響；5和10 mg/L染料木黃酮組均成倍升高G2/M期細胞比例并增加凋亡率，10 mg/L染料木黃酮還進一步的升高了S期細胞比例；2.5 mg/L順鉑+5 mg/L染料木黃酮和2.5 mg/L順鉑+10 mg/L染料木黃酮組可使G2/M期阻滯和細胞凋亡得到顯著加強. 各組SKOV3細胞G1期比例隨著不同濃度染料木黃酮與順鉑的處理而改變，經直線相關分析，表明細胞凋亡和G1期細胞比例呈負相關（rs=-0.953， P<0.05），與G2/M期+S期的細胞比例成正相關（表1）.表1不同濃度染料木黃酮與順鉑誘導的SKOV3細胞周期和凋亡率的改變(略)

3討論

鉑類藥物是卵巢癌聯合化療方案中最常用的藥物，而卵巢癌對鉑類藥物的耐藥性及其毒副作用常常導致化療方案難以奏效. 近年來研究表明染料木黃酮具有抑制腫瘤細胞生長、促進凋亡的作用，可以增強前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤細胞對化療的敏感性，提高化療的效果，而且可以在不降低療效的前提下減少化療藥物用量，從而減輕化療的毒副反應［1-2］. 那么染料木黃酮能否增強傳統化療藥物順鉑對耐藥卵巢癌的療效呢？在實驗中我們發現SKOV3細胞明顯對順鉑耐藥，其IC50達到9.9 mg/L，遠遠超出順鉑的血漿峰值濃度（2.5 mg/L），而染料木黃酮與順鉑聯用時則表現出不同程度的協同作用，可明顯降低順鉑對SKOV3細胞的IC50，10 mg/L濃度以上的染料木黃酮可將順鉑對SKOV3細胞的IC50降至血漿峰值濃度以下，兩藥聯用也顯著的提高了凋亡率. 采用熒光顯微鏡觀察細胞形態，也可以發現血漿峰值濃度的順鉑對SKOV3細胞幾乎沒有什么影響，而與染料木黃酮聯用時可誘導出大量凋亡.

流式細胞術結果提示周期阻滯和細胞凋亡是染料木黃酮與順鉑發揮協同作用的重要機制，而且兩藥協同誘導細胞凋亡與周期阻滯是有聯系的. 凋亡率與G1期比例呈負相關， 間接的表明染料木黃酮與順鉑聯用誘導凋亡和阻滯G2/M期和干擾S期進程有關. 染料木黃酮可將SKOV3細胞阻滯于G2/M期，并誘導一定程度的細胞凋亡，而G2/M期正是順鉑誘導凋亡的重要時期［5］，兩者在這方面的一致性可能是它們發揮協同作用的基礎. 在我們的結果中，10 mg/L 染料木黃酮可進一步地將一部分細胞阻滯于S期. 實驗中發現5，10 mg/L染料木黃酮聯合順鉑作用時，G2/M期細胞比例相近，但凋亡率卻差別甚遠，提示兩種濃度的染料木黃酮對S期干擾程度的不同可能是造成凋亡率差異的原因. S期即DNA合成期，核苷酸雙鏈在S期分離，對外界環境非常敏感，更易于被腫瘤化療藥物所殺傷，干擾S期進程理論上應該會增加凋亡率. Kolfschoten等［6］采用順鉑加阿霉素化療方案治療15例包含不同組織學類型的卵巢癌移植瘤裸鼠，發現順鉑不敏感裸鼠S期腫瘤細胞比例較低，而S期腫瘤細胞比例較高的裸鼠對順鉑敏感性較強，順鉑敏感性與S期細胞比例成正相關. 高濃度的染料木黃酮可干擾S期進程可能是其與順鉑發揮協同作用的另外一個重要機制.

我們的研究表明，染料木黃酮和順鉑可協同抑制耐藥卵巢癌細胞SKOV3的增殖、促進其凋亡，這對強化常規化療的效果、減輕化療的毒副作用是非常有意義的. 其作用機制可能與染料木黃酮干擾細胞周期，從而增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性有關. 染料木黃酮增強順鉑對耐藥卵巢癌細胞SKOV3的殺傷作用的分子機制還有待探討.

【參考文獻】

［1］ Li Y， Ahmed F， Ali S， et al. Inactivation of nuclear factor kappaB by soy isoflavone genistein contributes to increased apoptosis induced by chemotherapeutic agents in human cancer cells［J］. Cancer Res，2005，65(15):6934-6942.

［2］ Li Y， Ellis KL， Ali S， et al. Apoptosisinducing effect of chemotherapeutic agents is potentiated by soy isoflavone genistein， a natural inhibitor of NFkappaB in BxPC3 pancreatic cancer cell line［J］. Pancreas，2004，28(4):e90-e95.

［3］ 李也鵬，胡成平，吳鄂生. NS398和順鉑聯用對人肺腺癌增殖的影響及其機制初步探討［J］. 中國肺癌雜志，2005，8(1):8-13.

［4］ Soriano AF， Helfrich B， Chan DC，et al. Synergistic effects of new chemopreventive agents and conventional cytotoxic agents against human lung cancer cell lines［J］. Cancer Res， 1999，59(24):6178-6184.

［5］ Bose RN. Biomolecular targets for platinum antitumor drugs［J］. Mini Rev Med Chem，2002，2(2):103-111.

［6］ Kolfschoten GM， Hulscher TM， Pinedo HM， et al.Drug resistance features and Sphase fraction as possible determinants for drug response in a panel of human ovarian cancer xenografts［J］. Br J Cancer，2000，83(7):921-927.