【關鍵詞】 解脲脲原體；氟喹諾酮；最小抑菌濃度；gyrA耐藥基因

摘要： 目的 探討解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥狀況與gyrA基因突變之間的關系。方法 對鑒定確認的解脲脲原體臨床分離株，采用微量肉湯稀釋法檢測其環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星的最小抑菌濃度（MIC），隨機抽取28株菌株，PCR擴增gyrA基因并測序，采用Blast比對法分析臨床菌株與標準菌株的序列差異。結果 解脲脲原體的環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星MIC50分別為8，4和2mg/L；MIC90分別為64，16和8mg/L；在28株解脲脲原體菌株中，經測序分析發(fā)現gyrA基因3種突變形式：(1)101位丙氨酸改變?yōu)槔i氨酸；(2)112位天冬氨酸改變?yōu)楣劝彼幔?3)267位堿基T缺失。具有基因突變的菌株其MIC明顯高于沒有突變的菌株。結論 江蘇省部分地區(qū)解脲脲原體對第1、2代氟喹諾酮類藥物耐藥嚴重，此類藥物不再適用于治療解脲脲原體感染；解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥主要是由于gyrA基因突變導致相應氨基酸改變所介導。

關鍵詞： 解脲脲原體；氟喹諾酮；最小抑菌濃度；gyrA耐藥基因

Study on fluroquinolones resistance and GyrA resistance gene mutation of ureaplasma urealyticum

Abstract： Objective To study the status of fluoroquinolones resistance and GyrA gene mutation of U.urealyticum.Methods In vitro susceptibilities (Minimum inhibitory concentration，MIC) to ciprofloxacin，ofloxaxin and levofloxacin of 84 U.urealyticum strains from clinical patients were determined by a broth microdilution method.Specific fragments of gyrA genes of randomly selected 28 strains were amplified by PCR and sequenced.Blast program was used to analyze and compare the sequence of clinical isolates with standard strain T3.Results For U.urealyticum the MIC50 of ciprofloxacin，ofloxacin and levofloxacin were 8，4 and 2mg/L respectively;Their MIC90 were 64，16 and 8mg/L respectively.Three alterations of GyrA in 28 U.urealyticum strains were found:(1)A alanine to valine substitution at position 101;(2)A aspartic acid to glutamine substitution at position 112;(3) An absence of T base at position 267.U.urealyticum with GyrA alterations was more resistant to fluoroquinolones.Conclusion Most of U.urealyticum isolated from Jiangsu province are resistant to ciprofloxacin，ofloxacin，and levofloxacin，and these three antibiotics should not used to treat infection of U.urealyticum.Resistance of U.urealyticum to fluroquinolones is mainly due to alterations of GyrA.

Key words： ureaplasma urealyticum；fluoroquinolones；minimum inhibitory concentration (MIC)；gyrA resistance gene 解脲脲原體（Ureaplasma urealyticu，Uu）是導致男女泌尿生殖系統(tǒng)感染的主要病原之一。與其他各種導致感染性疾病的病原微生物一樣，Uu對各種抗生素也產生了耐藥性，且耐藥現象日益嚴重。氟喹諾酮類藥物是治療支原體感染的三大類抗生素之一，隨著環(huán)丙沙星等的廣泛使用，已發(fā)現Uu逐漸對其產生了耐藥性。為了解目前Uu對氟喹諾酮類藥物的耐藥狀況及其gyrA基因的突變情況，我們對江蘇省部分地區(qū)分離的Uu臨床菌株進行了實驗研究。結果報告如下。

1 材料與方法

11 菌株來源 84株Uu分離自南京市某醫(yī)院婦產科就診者和南京市、南通市疾病預防控制中心性病皮膚病門診就診者。采用支原體ID試劑（法國生物梅里埃公司）分離培養(yǎng)，并經022μm濾膜過濾培養(yǎng)和特異性PCR檢測等進行鑒定確認。

12 Uu對氟喹諾酮類藥物的敏感性試驗 采用微量肉湯稀釋法測定環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星等3種抗生素（江蘇省藥品檢驗所）測定Uu臨床分離菌株的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）〔1〕。質控菌株為Uu T3標準菌株。若T3標準菌株的最小抑菌濃度(MIC)在質控范圍內，且各陽性對照孔變紅、抗生素對照及陰性對照孔不變色，則認為實驗有效，記錄被測菌株的MIC結果。

13 gyrA耐藥基因的檢測和序列分析 取陽性培養(yǎng)物200μl，離心15000r/min，5min，棄上清液。加裂解液A50μl、裂解液B2μl，混勻后置入55℃水浴1h，并置入95℃水浴5min。10000r/min，離心30s，上清液即為擴增的模板液。采用gyrA耐藥基因檢測試劑盒（無錫克隆遺傳技術研究所）進行gyrA基因特異片段的PCR擴增，其正向引物序列為5′TTG CTG CTT TCG AAA ACG G3＇，反向引物序列為5＇CTG ATG GTA AAA CAC TTG G3＇，DNA片段為336bp。擴增程序為94℃預變性5min，然后按94℃ 20s→57℃ 30sec→72℃ 60s共循環(huán)35周期，最后72℃延長5min。對擴增產物進行電泳檢測，gyrA基因檢測陽性時將剩余的擴增產物送交上海生工公司進行測序，測序引物為PCR正向引物。

14 統(tǒng)計分析 采用SAS81統(tǒng)計軟件進行兩樣本t檢驗，分析gyrA基因突變組與未突變組間氟喹諾酮類藥物的MIC差異，采用Fisher精確概率法比較對環(huán)丙沙星不同敏感程度菌株之間的gyrA基因突變檢出率。

2 結果

21 Uu對氟喹諾酮藥物的敏感性（表1） 藥敏實驗結果顯示，所分離的Uu臨床菌株對環(huán)丙沙星的耐藥性最高（5952%），對左旋氧氟沙星和氧氟沙星的耐藥性也達40%以上。

表1 氟喹諾酮藥物對解脲脲原體的MIC及解脲脲原體的耐藥狀況（略）

22 Uu菌株的gyrA耐藥基因檢測結果 分層隨機抽取的28株菌株中，經測序分析發(fā)現，gyrA基因出現3種突變形式，即302位堿基C→T使101位丙氨酸改變?yōu)槔i氨酸、336位堿基C→A使112位天冬氨酸改變?yōu)楣劝彼岷?67位堿基T缺失。

表2 gyrA基因突變與氟喹諾酮類抗生素MIC（mg/L）水平的關系（略）

23 gyrA基因突變與Uu氟喹諾酮類耐藥性的關系(表2) 具有基因改變的菌株其氟喹諾酮類藥物MIC幾何均數明顯高于沒有突變的菌株。環(huán)丙沙星耐藥組gyrA基因突變率為7059%（12/17），顯著高于中敏組的25%（1/4）和敏感組（0/7）（fisher精確概率P=00030）。

3 討論

氟喹諾酮類藥物因其抗菌譜廣且價格較低而廣泛應用于臨床，但病原體極易被藥物誘導而產生耐藥。本次研究測得的環(huán)丙沙星和氧氟沙星的MIC50均高于4mg/L，可見Uu對其敏感性已有明顯下降。按照現有文獻中報道的Uu對氟喹諾酮類藥物的耐藥標準〔2〕及支原體IST 2種商業(yè)試劑盒的藥敏標準，本次檢測的江蘇省部分地區(qū)Uu臨床分離株對氟喹諾酮類耐藥率均高于40%，其中對環(huán)丙沙星耐藥率達60%，與國內其他研究結果基本一致〔3，4〕，因此，此類氟喹諾酮類藥物不再適用于治療Uu感染。支原體屬對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制被認為是由于藥物靶位DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ特定區(qū)域的改變而引起，而導致酶特定區(qū)域氨基酸改變的分子基礎是編碼酶的基因突變。編碼DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ的基因分別為gyrA和parC基因，基因上的一段與氟喹諾酮類耐藥相關的核苷酸序列被稱為喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）〔5-7〕。本研究發(fā)現，gyrA基因出現302位堿基C→T和336位堿基C→A的突變，分別導致101位丙氨酸改變?yōu)槔i氨酸和112位天冬氨酸改變?yōu)楣劝彼幔煌瑫r還發(fā)現2株菌株存在gyrA基因267位堿基T的缺失。在這3種改變中，以112位天冬氨酸改變?yōu)楣劝彼嶙疃啵c文獻報道一致〔6，7〕；而101位丙氨酸改變?yōu)槔i氨酸和267位堿基T缺失尚未見報道，我們已在美國生物基因庫（GenBank）中登錄（注冊號：DQ683565）。研究還顯示，在敏感菌株沒有發(fā)現gyrA基因突變，具有基因突變的菌株其氟喹諾酮類藥物的MIC明顯高于沒有突變的菌株，進一步證實了氟喹諾酮類的耐藥主要是由gyrA基因突變導致的氨基酸改變所引起。

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