【關鍵詞】 DNA聚合酶β； 轉染；食管腫瘤；腫瘤細胞，培養的；抗藥性，腫瘤；四甲基偶氮唑藍

DNA聚合酶beta (polymerase beta gene，polβ)廣泛存在于哺乳動物細胞核內，是一條Mr為39×103的單肽鏈小分子蛋白，由355個氨基酸組成，是目前已知的最小的DNA聚合酶. 在堿基切除修復，DNA復制，跨損傷合成中發揮重要作用，還與基因組不穩定性有關［1-4 ］. 近年來的研究表明在多種腫瘤組織及腫瘤細胞株內polβ mRNA的表達都明顯增加［5-6］. polβ與腫瘤細胞耐藥性的關系也逐漸引起人們的注意. 本實驗通過研究人食管癌順鉑(concentration of cisplatin， cDDP)耐藥細胞系Ec9706/cDDP和穩定高表達人野生型polβ的Ec9706細胞中polβ的表達水平及其對抗腫瘤藥cDDP的敏感性，旨在進一步探討polβ高表達與食管癌細胞耐藥的相關性.

1材料和方法

1.1材料

人食管癌細胞株Ec9706由中國醫學科學院腫瘤研究所提供；cDDP山東齊魯藥業股份有限公司產品；RPMI 1640培養液Gibco/ BRL公司生產；四甲基偶氮唑藍(MTT)為美國Sigma產品；pEGFPC3 (Clonetech公司)；野生型人polβ重組綠色熒光蛋白表達載體pEGFPAC3(微生物學與免疫學教研室趙國強教授惠贈)；G418(寶生物公司)；6TG (美國Sigma公司)；LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）；引物2對，由上海生工公司合成：polβRNA檢測引物：上游5′TGTTTGCCAGCTTCCC AGTA3′，下游5′CTCCA GTGACTCCCAAGGGA3′，擴增長度206 bp；βactin引物:上游5′TC AAGATCATTGCTCCTCCTGA3′，下游5′CTCGTCATACTCCTGCTT GCTG 3′，擴增長度113 bp.

1.2方法

1.2.1cDDP誘導耐藥細胞系Ec9706/cDDP的建立

采用cDDP中等濃度、間歇作用方法建株. 以終濃度為2 mg/L的cDDP培養基沖擊對數生長期的Ec9706細胞，48 h后棄去含藥培養基，PBS洗3次，換新鮮培養基. 1～2 d換液1次，洗去死亡細胞，待形成細胞克隆時傳代，恢復穩定生長后提高cDDP濃度再次沖擊，如此反復作用直至細胞可在濃度為0.5 mg/L的cDDP培養液中維持培養. 1.2.2穩定高表達人野生型polβ的Ec9706細胞系的建立

取對數生長期Ec9706細胞以2.5×105個/孔接種于6孔板，待細胞融和度達60%～70%時，以正常Ec9706細胞作對照，分組轉染pEGFPC3 (空質粒)和pEGFPAC3，按轉染試劑LipofectamineTM 2000操作說明書進行. 4～6 h后，棄轉染液換2 mL含10 mL/L胎牛血清的培養液繼續培養. 48 h后以含750 mg/L G418的培養液篩選，約14 d后對照Ec9706細胞全部死亡，轉染組改用含200 mg/L G418的培養液，陽性克隆擴大培養后，建立穩定傳代轉染細胞系. 轉染pEGFPC3， pEGFPAC3的細胞分別用Ec9706C3， Ec9706AC3表示.

1.2.3細胞形態學觀察普通倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態，熒光顯微鏡觀察轉染后細胞綠色熒光.

1.2.4RTPCR檢測polβ mRNA的表達取細胞各1瓶，按Trizol試劑盒說明書抽提細胞總RNA，逆轉錄后PCR擴增. PCR反應體系30 μL： 10×buffer 3 μL，dNTP 2.4 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.5 U，逆轉錄產物5 μL. PCR反應條件: 94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，35個循環后，72℃延伸5 min. 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳. SYNGENE凝膠分析系統軟件分析電泳結果，用polβ與β actin積分吸光度值的比值表示polβ基因的相對表達水平.

1.2.5MTT法測細胞對cDDP敏感性的變化常規MTT法檢測，酶標儀以波長550 nm測各孔A值，計算相對抑制率（％）＝（1-加藥孔A值/對照孔A值）×100％，用IC50計算器軟件計算50%細胞生長抑制所需的藥物濃度( IC50)，耐藥指數(RI) =待測細胞IC50/ Ec9706細胞IC50.

統計學處理： 用SPSS 10.0統計軟件處理數據，數據以x±s表示，t檢驗，α=0.05.

2結果

2.1各組細胞形態

經過9 mo的體外誘導篩選獲得了在含0.5 mg/L的cDDP培養液中生長良好的耐藥細胞系Ec9706/cDDP. 誘導過程中在加入cDDP后24 h倒置顯微鏡下可見大部分細胞因死亡而漂浮起來，培養液略渾濁，殘留貼壁細胞發生明顯改變，大小不均勻，有巨細胞產生，形態不規則，細胞突起及部分細胞質中黑色顆粒較多，生長緩慢，于20 d左右可形成細胞克隆，傳代后逐漸接近原來細胞形狀（圖1）. 此外，倒置顯微鏡下觀察轉染前后細胞形態無明顯差異，均呈多角形或圓形；在熒光顯微鏡488 nm波長下Ec9706AC3與Ec9706C3細胞呈現綠色熒光，而對照Ec9706細胞則無熒光.

2.2RTPCR結果

耐藥細胞Ec9706/cDDP與親本細胞RTPCR后電泳結果見圖2. 經灰度掃描后兩種細胞內polβ mRNA與βactin相比其相對表達水平分別為0.49±0.09，0.81±0.16，Ec9706/cDDP中polβ的表達高于親本細胞（P<0.05），是親本細胞的1.65倍；轉染細胞RTPCR后電泳結果見圖3. 經灰度掃描后Ec9706，Ec9706C3及Ec9706AC3細胞內polβ mRNA與βactin相比，其相對表達水平分別為0.52±0.13，0.48±0.11，1.21±0.15，表明Ec9706AC3細胞內polβ的表達高于Ec9706及Ec9706C3細胞（P<0.05），是Ec9706細胞的2.33倍；而Ec9706C3細胞內polβ的表達與Ec9706細胞相比較差異無統計學意義（P>0.05）. A: 正常不加藥的Ec9706細胞；B: 加藥后24 h細胞；C: 加藥后20 d左右形成的克?。籇: Ec9706/cDDP細胞.

2.3各組細胞對cDDP的敏感性

經MTT法檢測，人食管癌cDDP耐藥細胞系Ec9706/cDDP的耐藥指數為15.70. 而Ec9706AC3對cDDP的耐藥指數為1.78，與Ec9706相比對cDDP的敏感性顯著降低（P<0.05），而對照轉染空質粒的Ec9706C3的IC50是Ec9706的0.97倍，與Ec9706相比對cDDP的敏感性無明顯改變（P>0.05）.

3討論

腫瘤細胞的耐藥機制有多種，包括藥物的蓄積降低、細胞解毒功能的增強、藥物靶蛋白（如拓撲異構酶TPO）量或活性的改變等. 通常MRP， mdr1， GST， TPO與二氫葉酸還原酶等基因的異常表達與腫瘤的耐藥關系密切［7-8］. 近年來，DNA修復能力增強（如polβ表達增強）與耐藥性的關系也逐漸引起人們的注意. polβ于1971年由Weissbach等［9］在牛胸腺細胞中發現，通常情況下在體內恒定低水平表達，主要參與DNA修復，在堿基切除修復（base excision repair， BER）的過程中填補單核苷酸缺口，堿基摻入過程有很高的錯誤率，體外DNA聚合反應中單堿基錯誤摻入率為1/1000～1/6600，是哺乳動物體內復制保真度最低、最不精確的一種DNA聚合酶［10-11］. 細胞為了正常分化以及DNA的正常復制與修復，polβ在細胞內的表達水平必須維持到一個適量的穩定水平. 當polβ高表達時，可導致細胞自身突變率增加、遺傳不穩定性的發生以及對一些抗癌藥物產生耐受. 有學者報導，將表達polβ的質粒轉染如中國倉鼠卵巢細胞中發現轉染細胞對cDDP等化療藥物的敏感性降低［3］. 對cDDP耐藥的卵巢癌細胞株中polβ的表達比親本細胞增加了8倍［12］. 本研究誘導建立了人食管癌cDDP耐藥細胞系Ec9706/cDDP，該細胞耐藥指數達15.70，細胞內polβ表達是親本食管癌細胞Ec9706的1.65倍；同時采用脂質體轉染法將人野生型polβ重組綠色熒光蛋白表達載體pEGFPAC3導入食管癌細胞Ec9706后，其polβ表達是Ec9706細胞的2.33倍，對cDDP的敏感性降低，耐藥指數為1.78. 這些均表明polβ的高表達與腫瘤細胞對cDDP等的耐藥有關，polβ的高表達可引起耐藥性的產生，耐藥細胞中polβ的表達也會增高. 同時，研究發現轉染有polβ表達載體的Ec9706AC3細胞內polβ的表達高于耐藥細胞Ec9706/cDDP，而其耐藥指數卻低于Ec9706/cDDP細胞，說明體外誘導產生的耐藥細胞Ec9706/cDDP的耐藥機制有除polβ外其它機制的參與.