作者：伍慶 王興寧 張明時 曹桂紅

【摘要】 目的建立同時測定杜仲葉中蘆丁、槲皮素、山萘酚的高效液相色譜法。方法采用Spherisorb BDS C18柱（5 μm ，250 mm×4.6 mm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫（甲醇：0 min，30%；10 min，30%；30 min，50%；40 min，60%；50 min，30%），流速1 ml·min-1，檢測波長350 nm。結果樣品中蘆丁、槲皮素、山萘酚的加樣回收率分別為96%～98%，93% ～97%，96% ～101%；蘆丁、槲皮素、山萘酚的線性范圍分別為0.579～5.79 μg，r=0.999 9；0.12～1.20 μg，r=0.999 8；0.109～1.09 μg，r=0.999 9。 結論貴州不同產地杜仲葉藥材中蘆丁、槲皮素、山萘酚的含量差異很大。

【關鍵詞】 高效液相色譜法 杜仲葉 蘆丁 槲皮素 山萘酚

杜仲Eucommia ulmoides Oliv屬國家二級保護植物，是杜仲科杜仲屬的落葉喬木，中國特有植物種，系地質史上第四紀冰川運動殘留下來的占生孑遺樹種［1，2］。具補肝腎、強筋骨、安胎之功效， 主要用于治療腎虛腰痛， 筋骨無力， 妊娠漏血， 胎動不安， 高血壓病［3］，其皮是我國特有的名貴滋補藥材，近代研究發現杜仲葉與皮含有相同的化學成分，具有相同的藥理作用，杜仲葉也是各種名貴保健品的重要原料。黃酮類化合物是杜仲藥材的主要有效成分之一， 具有多種生物活性，杜仲中黃酮類化合物含量的高低， 也是判斷杜仲藥材及其相關產品的重要指標［4，5］。近年來，對杜仲黃酮類含量的測定多采用比色法和高效液相色譜法［6，7］，測定多為單一指標蘆丁的定性定量分析，對于同時測定黃酮類物質（蘆丁、槲皮素、山萘酚）3種有效成分還未見報道。為了充分合理的開發利用貴州省的杜仲資源，本文采用高效液相色譜法同時對杜仲葉中的黃酮類3種有效成分進行了定性定量分析。

1 儀器與試藥 Waters 515 泵， 2996光電二極管檢測器(PAD) ，7725i手動進樣器， Spherisorb BDS C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱， Empower 色譜工作站。 蘆丁對照品（批號086-9303），槲皮素對照品（批號 081-9003），山萘酚對照品（批號 0861-9901）均購于中國藥品生物制品檢定所；杜仲葉均采自貴州各杜仲產地（經貴陽中醫學院劉克漢老師鑒定）；甲醇色譜純、磷酸為分析純；水為二次重蒸水。

2 方法與結果

2 .1 溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液 分別精密稱取對照品適量，用60%乙醇溶解后置于25 ml的容量品，并稀釋至刻度，配置成含蘆丁2.795 mg·ml-1、槲皮素0.600 mg·ml-1、山萘酚0.545 mg·ml-1的對照品儲備溶液。

2.1.2 對照品溶液 分別精密吸取對照品儲備溶液1 ml，置于10 ml的容量品中，用60%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，配置成含蘆丁0.279 5 mg·ml-1、槲皮素0.060 0 mg·ml-1，山萘酚0.054 5mg·ml-1的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液 精密稱取杜仲葉粉末（過60目篩）2 g，于100 ml錐形品中，加入60 ml 60%乙醇溶液，稱定重量，冷浸8 h、超聲提取3 h，冷卻后用相應的醇濃度補足重量。經0.45 μm的濾膜濾過，續濾液供HPLC分析。 2.2 色譜條件色譜柱為Spherisorb BDS C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫（甲醇：0 min，30%；10 min，30%；30 min，50%；40 min，60%；50 min，30%），流速：1 ml·min-1，柱溫35℃檢，檢測波長350 nm。在該色譜條件下，蘆丁、槲皮素、山萘酚分離良好，且不受藥材中雜質的干擾。理論塔板數不小于4 000。見圖1。

圖1 蘆丁、槲皮素、山萘酚對照品色譜圖 （略）

圖2 杜仲葉樣品色譜圖（略）

2.3 線性關系考察 分別精密量取對照品溶液依次進樣2，5，8，11，14，17，20 μl。按“2.2”色譜條件分析，以Y（AV.S）為峰面積，X（μg）為進樣量，蘆丁、槲皮素、山萘酚方程分別為：Y蘆丁=1 14 28X+6 91.404，r=0.999 9、Y槲皮素=2 022 916X-5 760.250，r=0.999 8、Y山萘酚=2 177 870X-6 649.655，r=0.999 9。結果表明，蘆丁、槲皮素、山萘酚分別在0.579～5.79，0.12～1.20，0.109～1.09 μg間呈良好的線性關系。

2.4 精密度實驗對同一份杜仲葉樣品平行測定5次， 蘆丁、槲皮素、山萘酚的RSD分別為：0.23%，1.5%，0.53% （n=5）。

2.5 重復性實驗精密稱同一份杜仲葉樣品5份，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下分別測定，蘆丁、槲皮素、山萘酚的RSD分別為：0.76%，0.69%，0.60%（n=5）。

2.6 回收率實驗精密稱取已測含量的杜仲藥材粉末9份，每份2 g，按樣品含蘆丁、槲皮素、山萘酚的80%，100%，120%精密加入蘆丁、槲皮素、山萘酚對照品儲備溶液，按“2.1.3”的方法制備供試溶液，進樣量10 μl。結果蘆丁、槲皮素、山萘酚的回收率分別為96%～98%，93% ～97%，96% ～101%；精密度（RSD）分別為1.7%～2.0%，1.5%～2.7%，0.9%～2.5%(n=3)結果見表1。

2.7 供試品溶液穩定性實驗取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12h測定，蘆丁、槲皮素、山萘酚含量的RSD分別為1.7%，2.2%，1.9%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.8 樣品的測定分別取貴州不同產地的杜仲葉藥材按“2.1.3”方法制備供試品溶液、按“2.2”的色譜條件進行含量測定。結果見表2。實驗結果表明，貴州不同產地的杜仲葉中的蘆丁、槲皮素、山萘酚的含量差異很大，其含量關系為，威寧＞清鎮＞熄峰＞遵義＞大方＞羅甸；由于對樹齡的估計沒有準確性，實驗中以杜仲樹胸徑進行比較，關系為：清鎮＞遵義＞熄峰＞大方＞威寧＞羅甸，由結果可知杜仲葉黃酮類成分的積累和杜仲樹胸徑的大小沒有直接聯系。

表1 回收率實驗結果（略）

表2 杜仲葉藥材含量測定結果（略）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 蘆丁、槲皮素、山萘酚屬于黃酮類化合物，易溶于水及強極的溶劑中，本文選擇甲醇、乙醇和水3種溶劑作為提取溶劑，結果表明，以60%的乙醇溶液作為提取溶劑時，蘆丁、槲皮素、山萘酚提取較完全。

3.2 提取方法的選擇本文考慮了超聲、回流、索氏提取3種提取方法，發現超聲提取效率明顯高于其他兩種提取方法，這和文獻報道的黃酮類提取方法結果一致［6］；實驗中通過比較了冷浸時間、料液比、提取時間對提取率的影響。結果表明，以冷浸8 h、料液比1∶30、超聲提取3 h，提取效果最佳。

3.3 檢測波長的選擇蘆丁、槲皮素、山萘酚的對照品溶液進行PDA全波長紫外分析，并比較各組分的紫外吸收強度，對各波長進行比較，發現在350 nm處3組分都具有較好的靈敏度，應此，選擇350 nm為檢測波長。

3.4 色譜柱的選擇在實驗過程中比較了不同品牌的C18色譜柱對檢測結果的影響，發現Diamonsil C18柱分離樣品時間較長，蘆丁脫尾嚴重，分離度差；waterC18柱不能將蘆丁和雜質峰完全分離；Spherisorb BDS C18可使3組分與雜質很好的分離，且峰形較好，靈敏度高，適合黃酮類物質的分離。 3.5 流動相的選擇實驗中比較了乙腈與磷酸水溶液，甲醇與磷酸水溶液對樣品分離的影響，發現用乙腈作為流動相時峰形較好，但雜質出峰較快，不能與有效成分完全分離；使用甲醇作為流動相時效果較明顯，經過梯度洗脫可將雜質完全分離，并調整磷酸的比例，以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫效果最佳。

3.6 pH值對提取率的影響實驗中比較了鹽酸加入量水解黃酮苷對提取率的影響，發現隨著pH的增加蘆丁、槲皮素、山萘酚的含量變化不大，故實驗中采用直接加入60%乙醇溶液進行處理。

3.7 產地對黃酮類含量的影響含量測定結果表明，貴州不同產地杜仲葉藥材黃酮類成分含量差異很大，其中以威寧縣平均海拔兩千多米的杜仲葉總黃酮含量最高，以羅甸平均海拔五百多米的最低。可知海拔高度對黃酮類成分的積累具有一定的影響，對于影響黃酮類成分積累的主要環境因子還有待進一步研究。 本實驗方法簡便，快速準確，可用于杜仲藥材及其相關產品的質量控制和評價。

【參考文獻】 ［1］ 張康健，王 藍，張鳳云， 等. 杜仲葉與皮有效成分含量的比較研究［J］. 西北林學院學報， 1996， 11 (2)：42. ［2］ 張康健，馬希漢，馬 梅， 等. 杜仲葉次生代謝物積累動態研究［J］. 林業科學， 1999， 35 (2)：15. ［3］ 余濟海，鄒盛勤.高效液相色譜法同時測定杜仲葉中蘆丁和槲皮素含量的研究［J］. 安徽農業科學，2006，34(10)：2168. ［4］ 張康健，王亞琴，馬希漢，等. 杜仲葉次生代謝物生態學初步研究初報［J］. 林業科學，1999，35 (6)：28. ［5］ 張德權，臺建詳，付 勤. 生物類黃酮的研究及應用概況［J］. 食品與發酵工業，1999，25 (6)： 52. ［6］ 羅思齊. 中草藥活性成分含量測定概述［J］. 中草藥，1989，20 (9)：19. ［7］ 尉 芹，王冬梅，馬希漢，等.杜仲葉總黃酮含量測定方法研究［J］. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2001，29(5)：119.