作者：吳創(chuàng)鴻 陸堅(jiān) 鄧啟文 張扣興

【摘要】 目的 了解深圳地區(qū)陰溝腸桿菌中qnrA基因的流行情況、基因定位及其介導(dǎo)喹諾酮耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制。方法 收集臨床分離的陰溝腸桿菌45株，采用PCR法結(jié)合測(cè)序的技術(shù)篩查qnrA基因，大質(zhì)粒提取技術(shù)、Southern雜交和接合傳遞試驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)粒定位，瓊脂對(duì)倍稀釋法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。結(jié)果 45株陰溝腸桿菌中，7株P(guān)CR法及測(cè)序證實(shí)為qnrA基因。7株菌中6株菌所攜質(zhì)粒被成功提取并進(jìn)行Southern雜交，qnrA基因定位于80～200kb大小的低拷貝數(shù)天然質(zhì)粒上。4株菌成功進(jìn)行接合傳遞試驗(yàn)，使接合子對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值提高了32～64倍。結(jié)論 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrA在深圳地區(qū)陰溝腸桿菌中具有較高的流行率，可能是導(dǎo)致陰溝腸桿菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥獲得性耐藥的重要原因。

【關(guān)鍵詞】 qnrA基因 陰溝腸桿菌 喹諾酮 耐藥 質(zhì)粒

Plasmidmediated quinolone resistance in clinical isolates

ABSTRACT Objective To investigate the prevalence and location of qnrA gene in clinical isolates of Enterobacter cloacae and its function in the development of quinolone resistance. Method Fortyfive Enterobacter cloacae were screened for the qnrA gene by PCR and then conformed with direct sequencing. Large plasmid extraction and Southern hybridization were done to determine the location of qnrA. Conjugation experiments were done to determine the transferability and its effects in the development of quinolone resistance. Results qnrA were detected in 7 (15.6%) of 45 strains. The qnrA sequence matched that of NCBI GenBank with 100%. Plasmid extraction and Southern hybridization were succeed in 6 stains. The qnrA were located in plasmids in size of 80～200kb. Conjugation experiments were done in 4 strains. Transconjugants had 32～64fold increases in the MIC of ciprofloxacin relative that of the recipient but were still susceptible to ciprofloxacin according to CLSI stardard. Conclusion Transferable plasmidmediated quinolone resistance associated with qnrA were high prevalent in clinical isolates of Enterobacter cloacae from Shenzhen city and may contribute to the quinolone resistance of thiese bacteria.

KEY WORDS qnrA; Enterobacter cloacae; Quinolone; Drug resistance; Plasmid

1998年，Martinez等首次證實(shí)肺炎克雷伯菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥存在質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，并將該耐藥基因命名為qnr(現(xiàn)命名為qnrA)［1］。之后我國(guó)學(xué)者王明貴等研究發(fā)現(xiàn)qnrA基因在耐喹諾酮類抗菌藥大腸埃希菌中的檢出率高達(dá)7.7%，提示qnrA基因在介導(dǎo)腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制方面可能發(fā)揮著重要作用，引起廣泛關(guān)注［2］。

目前陰溝腸桿菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，且對(duì)喹諾酮類抗菌藥的耐藥性迅速上升，給臨床抗感染治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［3，4］。為了解qnrA基因在介導(dǎo)陰溝腸桿菌耐藥性播散方面的作用，本研究采用PCR技術(shù)對(duì)2004～2005年我院臨床分離的陰溝腸桿菌進(jìn)行了qnrA基因攜帶率的篩查，DNA測(cè)序證實(shí)并與已報(bào)道的qnrA序列進(jìn)行比較，并通過Southern雜交及接合傳遞試驗(yàn)對(duì)qnrA基因進(jìn)行了質(zhì)粒定位，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株來源及鑒定

2003～2004年我院及深圳市人民醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)陰溝腸桿菌45株。采用法國(guó)BioMerieux公司API 20E系統(tǒng)進(jìn)行種屬鑒定。研究用菌株為E.coli J53/pMG252作為qnrA基因PCR檢測(cè)和Southern雜交檢測(cè)的陽性質(zhì)控株，E.coli J53 Azr(耐疊氮鈉)作為接合傳遞實(shí)驗(yàn)受體菌及MICs參照株，均由美國(guó)Jacoby教授提供。

1.2 抗菌藥物敏感性檢測(cè)

采用瓊脂稀釋法檢測(cè)臨床分離菌及接合子對(duì)環(huán)丙沙星的MICs值，其它抗菌藥物的敏感性采用KB法檢測(cè)。MH培養(yǎng)基和藥敏紙片均為Oxoid公司產(chǎn)品。結(jié)果按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)2005年版推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和陰溝腸桿菌ATCC13047。

1.3 qnrA擴(kuò)增和測(cè)序

采用PCR法并結(jié)合測(cè)序進(jìn)行PCR引物參照文獻(xiàn)［4］委托上海英駿生物有限公司合成。上游引物5′TCAGCAAGAGGATTTCTCA3′，下游引物5′GGCAGCACTATTACTCCCA3′，增片段為627bp。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min，95℃ 30s，45℃ 60s，72℃ 60s，循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物送上海英駿生物有限公司純化后直接進(jìn)行雙向測(cè)序。陽性對(duì)照菌株為E.coli J53 pMG252。

1.4 qnrA序列比較

所測(cè)序列用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接、校正后，采用美國(guó)國(guó)家信息中心(NCBI)在線分析工具Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)程序進(jìn)行分析，以確定耐藥基因型或基因變異情況。qnrA基因參比序列號(hào)為AY070235及AY259086。

1.5 質(zhì)粒分析及qnrA基因Southern雜交檢測(cè)

QIAfilter Plasmid Maxi Kit(QiaGen，德國(guó))提取質(zhì)粒，0.7%瓊脂糖電泳，采用LabImage軟件分析與E.coli V517及E.coli J53/pMG252所攜質(zhì)粒比較的結(jié)果，以確定其分子量大小。電泳結(jié)果拍照后，用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。以切膠純化的qnrA基因PCR產(chǎn)物為模板制備其檢測(cè)探針，按地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(博士德公司，武漢)說明書進(jìn)行操作。

1.6 接合傳遞試驗(yàn)

供體菌為臨床分離的qnrA陽性株，受體菌為E.coli J53 Azr。將供體菌、受體菌分別接種于LB平板上，35℃過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落分別接種于4ml的LB肉湯中，37℃>220r/min搖菌培養(yǎng)8～12ｈ。各取0.5ml供、受體菌于4ml的LB肉湯中，37℃靜止過夜培養(yǎng)。接合子以胰大豆瓊脂平皿篩選，平皿中含疊氮鈉(250μg/ml)及氯霉素(30μg/ml)、慶大霉素(20μg/ml)或四環(huán)素(20μg/ml)中的一種。在篩選平皿上生長(zhǎng)的菌落同時(shí)接種至含及不含環(huán)丙沙星(0.06μg/ml)的胰大豆瓊脂平皿上，以了解喹諾酮耐藥性是否同時(shí)轉(zhuǎn)移。此外，以PCR法對(duì)篩選出的接合子進(jìn)行qnrA基因檢測(cè)，陽性者重新進(jìn)行菌種鑒定，鑒定為大腸埃希菌者表明攜qnrA基因耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移成功。

2 結(jié)果

2.1 qnrA基因的檢測(cè)

采用PCR方法對(duì)臨床分離的45株陰溝腸桿菌進(jìn)行qnrA基因的篩查，7株(15.6%)得到了陽性擴(kuò)增條帶(Fig.1)。對(duì)全部PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所得序列采用Blastn程序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示7個(gè)樣本的序列均為qnrA基因，與上海王明貴報(bào)道的qnrA基因吻合率為100%。qnrA陽性的菌株對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值分別為0.5mg/L 3株、2mg/L 2株、4mg/L 1株，按CLSI折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)分別為敏感、中介和耐藥。

2.2 質(zhì)粒提取和qnrA基因Southern雜交定位

7個(gè)qnrA基因陽性株中成功提取了6株菌的質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒譜分析和Southern雜交檢測(cè)。質(zhì)粒譜分析顯示各分別攜帶了2～4個(gè)天然質(zhì)粒(Fig.2A)。以qnrA基因?yàn)槟０逯苽涮结樳M(jìn)行Southern雜交檢測(cè)顯示，qnrA基因大約存在于在80～200kb大小的低拷貝數(shù)天然質(zhì)粒上(Fig.2B)，其中Ec28攜qnrA的質(zhì)粒大于180kb，其它菌株攜qnrA的質(zhì)粒大、小基本相同，小于180kb。

2.3 質(zhì)粒接合傳遞試驗(yàn)及藥敏分析

以7株qnrA陽性的臨床分離菌為供體菌、耐疊氮化鈉的大腸埃希菌J53為受體菌進(jìn)行接合傳遞試驗(yàn)，其中4株菌攜qnrA的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)移。接合子獲得質(zhì)粒后對(duì)環(huán)丙沙星的MIC從0.008mg/L上升至0.25～0.5mg/L，提高32～64倍。接合子對(duì)環(huán)丙沙星MIC與臨床分離株比較尚有2～8倍差距。按CLSI標(biāo)準(zhǔn)接合子對(duì)環(huán)丙沙星仍在敏感范圍。

3 討論

陰溝腸桿菌在自然環(huán)境中廣泛分布，也是人和動(dòng)物腸道的正常菌群，目前已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一，常引起呼吸道、泌尿道、血液、傷口和燒傷部位感染。近年來的研究多注重于陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶及ESBLs使之對(duì)頭孢菌素類抗生素耐藥；而耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示我國(guó)臨床分離的陰溝腸桿菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥的耐藥率近年來迅速上升，目前已高達(dá)23.5%～40.6%［3，4］。因此，準(zhǔn)確闡述其耐藥性迅速產(chǎn)生的分子機(jī)制，對(duì)合理制定臨床防治措施及新藥研發(fā)具有重要意義。

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，藥物作用靶位的改變和外膜通透性下降是陰溝腸桿菌耐喹諾酮的重要機(jī)制［5］；qnrA在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)喹諾酮耐藥機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)［1，6］。qnrA基因定位在質(zhì)粒上，所編碼的蛋白由218個(gè)氨基酸殘基組成，屬五肽重復(fù)序列家族，可以保護(hù)大腸埃希菌DNA回旋酶免受喹諾酮類抗菌藥的干擾而產(chǎn)生耐藥性［7，8］。本研究接合傳遞試驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)，qnrA基因定位在質(zhì)粒上，可能是導(dǎo)致其耐藥性在臨床分離中株中水平傳播的主要原因。本研究還發(fā)現(xiàn)深圳地區(qū)陰溝腸桿菌qnrA基因有較高的流行率(15.6%)，同期檢測(cè)的184株大腸埃希菌中沒有發(fā)現(xiàn)qnrA的流行，91株肺炎克雷伯菌中也只有4株qnrA陽性。最近Corkill等報(bào)道，英國(guó)利物浦16株對(duì)頭孢塞肟和環(huán)丙沙星耐藥的陰溝腸桿菌中有9株(56.3%)qnrA陽性［9］；Robicsek等報(bào)道，美國(guó)各州頭孢他啶耐藥的71株腸桿菌屬細(xì)菌中12株(17%)qnrA陽性［10］，提示陰溝腸桿菌中qnrA有較高的流行率是普遍現(xiàn)象。

值得注意的是qnrA基因的檢出并不代表qnrA位于質(zhì)粒上。Poirel等報(bào)道弧菌科細(xì)菌的染色體上存在與qnrA基因高度同源性的序列［11］；另外，對(duì)qnrA的基因環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)，qnrA存在于I類整合子中，也提示qnrA可能會(huì)在染色體和質(zhì)粒之間水平移動(dòng)。本研究采用Southern雜交技術(shù)及接合傳遞試驗(yàn)進(jìn)行qnrA基因的定位。結(jié)果7株菌中6株菌攜qnrA基因的質(zhì)粒被成功提取，Southern雜交檢測(cè)證實(shí)qnrA基因定位于80～200kb大小的低拷貝數(shù)天然質(zhì)粒上，其中4株菌的qnrA基因被證實(shí)具有跨菌種水平傳播能力。以往報(bào)道qnrA多存在于耐環(huán)丙沙星的臨床分離株中，本研究卻顯示無論耐藥、中介還是敏感的細(xì)菌均可存在qnrA，接合子對(duì)環(huán)丙沙星也敏感，說明①qnrA只介導(dǎo)低水平耐藥；②臨床耐藥菌株中可能存在其它耐藥機(jī)制。我們正在對(duì)攜qnrA的臨床分離株進(jìn)行深入研究，初步結(jié)果顯示該類細(xì)菌常攜帶多種耐藥基因，多種耐藥機(jī)制并存從而表現(xiàn)為多重耐藥。雖然qnrA只介導(dǎo)低水平的喹諾酮的耐藥性，但由于qnrA既可以放大由DNA旋轉(zhuǎn)酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶IV、外排泵過度表達(dá)或膜通透性下降所致的喹諾酮耐藥性，又可以增加DNA旋轉(zhuǎn)酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶IV基因變異的選擇性［7，10］。因此在細(xì)菌耐藥性的發(fā)展中具有重要意義，需進(jìn)行深入研究如何防治該耐藥性的傳播和流行。