作者：肖永紅 劉健 王哲 李耘

【摘要】 目的 研究釀膿鏈球菌對大環內酯類抗菌藥物的耐藥表型與基因型。方法 采用瓊脂平板稀釋法測定97株釀膿鏈球菌對紅霉素、克林霉素、麥迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素和青霉素的敏感性；用雙紙片法檢測釀膿鏈球菌耐藥表型；用PCR方法檢測耐大環內酯的釀膿鏈球菌攜帶的耐藥基因。結果 97株釀膿鏈球菌中82株表現為對大環內酯類抗菌藥物不敏感，其中42株表現為cMLS型耐藥，37株為iMLS型耐藥，3株細菌為主動外排M型耐藥；82株對大環內酯不敏感的釀膿鏈球菌中77株檢測到耐藥基因，其中12株具有ermB基因，25株具有ermTR基因，2株具有mefA基因，21株同時具有ermB/ermTR基因，5株同時具有ermB/mefA基因，3株同時具有ermTR/mefA基因，9株同時具有ermB/ermTR/mefA基因，5株未能檢測到三種耐藥基因。結論釀膿鏈球菌對大環內酯類抗菌藥物的耐藥率較高，耐藥表型以cMLS和iMLS為主，耐藥基因以ermB和ermTR多見。

【關鍵詞】 釀膿鏈球菌 大環內酯類 耐藥表型 耐藥基因

Macrolides resistant phenotype and genotype of Streptococcus pyogenes

ABSTRACT Objective To investigate the macrolides resistant phenotype and genotype in Streptococcus pyogenes. Methods The minimum inhibitory concentrations of erythromycin， clindamycin， midecamycin， azithromycin， clarithromycin and penicillin against 97 clinical strains of Streptococcus pyogenes were tested with agar dilution method; the macrolides resistant phenotype and genotype of Streptococcus pyogenes were detected by Dtest and polymerase chain reaction. Results Eightytwo Streptococcus pyogenes were nonsensetive to at least one macrolide agent. The strains with cMLS， iMLS and M resistant phenotype were 42， 37 and 3 respectively. Seventyseven macrolides resistant strains were detected macrolide resistant genes， which were 12 strains with ermB， 25 strains with ermTR， 2 strains with mefA， 21 strains with both ermB and ermTR， 5 strains with both ermB and mefA， 3 strains with both ermTR and mefA， 9 strains with three genes， where as resistance genes were not detected in 5 isolats. Conclusions The macrolides resistance of Streptococcus pyogenes was highly prevalence in China. The major resistant phenotypes were cMLS and iMLS. ermB and ermTR were the main resistance genes.

KEY WORDS Streptococcus pyogenes; Macrolides; Resistance; Phenotype; Genotype

收稿日期：20060417

作者簡介：肖永紅，男，生于1965年，博士，教授。釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，Group A βhemolytic Streptococcus，GAS)是急性呼吸道及皮膚軟組織等感染的重要致病菌之一，常常引起人體各種化膿性炎癥，臨床常用青霉素、頭孢菌素和大環內酯類藥物進行治療。近年來，釀膿鏈球菌對不同抗菌藥物尤其是大環內酯類的耐藥性呈迅速增長趨勢，我國的耐藥監測數據顯示，從兒童口咽部分離的GAS對紅霉素的耐藥率為43.3%［1］，2003年上海地區分離的GAS對紅霉素、克林霉素的耐藥率分別為78.6%和66.7%［2］。為了解釀膿鏈球菌對大環內酯類藥物的的耐藥機制，明確其耐藥表型與基因型關系，指導臨床合理用藥，我們對97株釀膿鏈球菌進行了研究。

1 對象和方法

1.1 實驗細菌選擇2001～2003年來自北京、哈爾濱、南京、天津四城市六家三級甲等醫院、經臨床分離的上呼吸道感染和皮膚軟組織感染的釀膿鏈球菌97株，研究前經北京大學臨床藥理研究所細菌室重新鑒定。

1.2 方法

(1)最低抑菌濃度測定 采用CLSI/NCCLS標準的瓊脂平板稀釋法測定97株釀膿鏈球菌對紅霉素、克林霉素、麥迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素和青霉素的敏感性。抗菌藥物標準品購自中國藥品生物制品檢定所；培養基及孵育條件：加5%羊血的MH瓊脂，5% CO2環境35℃孵育24h；質控菌為金葡菌ATCC29213；結果判定參照CLSI/NCCLS 2001年標準。

(2)耐藥表型的檢測 采用雙紙片(D實驗)法檢測對任何一種大環內酯類耐藥的釀膿鏈球菌的耐藥表型，紅霉素紙片(15μg)和克林霉素紙片(2μg)均購自中國藥品生物制品檢定所。將上述兩種紙片間隔15～20mm均勻貼于涂布1.5×108CFU/ml菌液的5%羊血MH瓊脂平板上，35℃ CO2孵箱孵育18～24h后觀察，若細菌對紅霉素與克林霉素均耐藥，則為固有型MLS耐藥(cMLS型)；若對紅霉素耐藥而靠近紅霉素的克林霉素抑菌圈有缺損，呈“D”形改變，則為誘導型MLS耐藥(iMLS型)；若對紅霉素耐藥而對克林霉素敏感，靠近紅霉素的克林霉素抑菌圈無缺損，則為主動外排機制所致耐藥(M型)。

(3)耐藥基因的檢測 PCR檢測對大環內酯類耐藥的釀膿鏈球菌的耐藥基因，并通過DNA測序確定。

DNA模板的制備 采用SDS裂解法提取釀膿鏈球菌染色體DNA。

引物序列 mefA：正向引物5′AGTATCATTAATCACTAGTGC3′，反向引物：5′TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG3′；ermB：正向引物5′CGAGTGAAAAAGTACTCAACC3′，反向引物：5′GGCGTGTTTCATTGCTTGATG3′；ermTR：正向引物5′AGGTTATAATGAAACAGA3′，反向引物：5′GCATGACATAAACCTTCA3′。

PCR擴增 應用50μl PCR反應體系擴增erm、mefA基因，包括5.0μl緩沖液，2.5mmol/L MgCl2，200μmol dNTP，50pmol引物1和50pmol引物2，2 U Taq DNA聚合酶，50ng DNA模板；PCR反應條件：預變性93℃ 3min，變性94℃ 1min，退火52℃ 1min，延伸72℃ 1min，再延伸72℃ 5min，共35個循環。mefA、ermB、ermTR基因擴增陽性片段大小分別為345、557和207bp，以1.5%瓊脂糖凝膠，在1×TAE電泳緩沖液中100V電泳40min，溴化乙錠染色成像。

序列分析 分別選取兩株mefA、ermB、ermTR基因擴增陽性菌株的PCR產物送至北京奧科生物技術有限公司進行測序分析，確定擴增產物為目的片斷。

2 結果

2.1 釀膿鏈球菌對大環內酯類耐藥情況

97株釀膿鏈球菌對紅霉素、克林霉素、麥迪霉素、阿奇霉素和克拉霉素的耐藥率分別為67.0%、45.4%、48.5%、72.2%和60.8%，未發現青霉素耐藥菌株。釀膿鏈球菌對上述幾種抗菌藥物的MIC值及耐藥率見表1。

2.2 耐藥表型的檢測結果

97株釀膿鏈球菌中82株表現為對大環內酯類抗菌藥物中的至少一種不敏感，采用D試驗檢測其耐藥表型，其中42株細菌表現為固有型耐藥(cMLS)，占52.4%，37株為誘導型耐藥(iMLS)，占43.9%，僅3株細菌為主動外排型耐藥(M)，占3.7%。不同耐藥表型釀膿鏈球菌對抗菌藥物敏感性見表2。 表1釀膿鏈球菌對不同抗菌藥物的MIC測定結果表2 抗菌藥物對不同耐藥表型釀膿鏈球菌抗菌作用

2.3 耐藥基因的檢測結果

PCR結果表明，82株大環內酯不敏感的釀膿鏈球菌中77株檢測到耐藥基因，5株未檢測到以上三種耐藥基因，其中包括耐藥表型為cMLS、iMLS型各2株、M型1株。大多耐藥表型與基因型吻合，但一株M型檢測到所有三種基因，而1株iMLS型僅檢測到mefA基因，耐藥基因的檢測與分布情況見圖1、表3。

2.4 地區間耐藥表型和基因型的差異

本研究的釀膿鏈球菌來自北京、哈爾濱、南京、天津四個地區2001～2003年的臨床分離菌，發現北京、天津和南京耐大環內酯GAS耐藥表型以cMLS為主，所占比例分別為85.2%(23/27)，75.0%(3/4)，88.9%(8/9)， 而哈爾濱則以iMLS為主，所占比例為表3 耐大環內酯類釀膿鏈球菌的基因型與 表型檢測結果

3 討論

釀膿鏈球菌對大環內酯的耐藥始于20世紀50年代，近年來隨著大環內酯類藥物廣泛應用于臨床，釀膿鏈球菌對其耐藥性也顯著增加。PROTEKT(1999～2000年度)監測結果顯示［3］，包括日本、韓國、我國香港在內的亞洲地區，釀膿鏈球菌對紅霉素的平均耐藥率為18%，其中我國香港地區已達到28%；歐洲國家的平均耐藥率為10%，但地區差異明顯；澳大利亞的耐藥率僅為4%。我國相關研究資料較為有限，整體來看，大環內酯耐藥的釀膿鏈球菌發生率高于國外，在40%～90%之間［1～5］。

細菌對大環內酯類耐藥機制包括抗菌靶位改變(甲基化或變異)、主動外排、藥物滅活等三種類型，鏈球菌耐藥主要為前面兩種［6］。編碼抗菌靶位甲基化的基因為erm，表現為對大環內酯類、林可酰胺類、鏈陽霉素高水平耐藥；編碼主動外排的基因為mefA，表現為對14、15元環大環內酯類低度耐藥；不同細菌耐藥基因亞型不同，釀膿鏈球菌為ermTR、ermB和mefA，不同地區調查其耐藥基因型與表型分布差別較大。PROTEKT(1999～2000年度)研究顯示，來自全球143株耐大環內酯的釀膿鏈球菌中，以mefA基因介導的M表型所占比例最高(46.1%)，erm基因介導的cMLS表型位居第二(30.8%)，iMLS表型所占比例最低(23.1%)［7］。西班牙、德國、希臘、芬蘭和意大利等國耐大環內酯釀膿鏈球菌以mefA基因介導的M表型為主［8～12］；法國以ermB、ermTR基因介導的MLS表型為主［13］；韓國、我國臺灣和香港以MLS表型為主［14～16］。

本研究發現我國臨床分離的釀膿鏈球菌不但對大環內酯耐藥率較高，耐藥水平也較高，如對紅霉素的耐藥率為67%，對阿奇霉素更高達72.7%，對克林霉素耐藥率在45.4%，且MIC90均>256mg/L；耐藥表型研

表4不同地區耐大環內酯類釀膿鏈球菌的基因型與表型檢測結果(n=82)

地區株數〖〗表 型cMLSiMLSM基 因 型ermBermTRmefAermB/ermTRermB/mefAermTR/mefAermB/ermTR/mefA全陽性北 京27232281192141哈爾濱428340224152242南 京430100001012天 津981020070000合 計824237312252215395

究進一步證明高度耐藥的MLS型為我國GAS的主要表型，所占比例達96.3%，遠遠高于歐美與周邊國家水平，至于地區間存在的cMLS或iMLS表型與基因型間的差異，有待進一步研究；分子生物學結果顯示，耐大環內酯GAS的基因型和表型一致，絕大多數細菌擴增到ermB、ermTR基因，mefA所占比例極低。這些結果與國外以mefA基因介導的M性低水平耐藥為主情況不一致，而與我國周邊地區和國家情況類似，這種高水平的耐藥是否與我國長期應用大環內酯類藥物有關尚待深入研究。

長期以來，大環內酯類，特別是新型大環內酯類藥物作為臨床治療革蘭陽性菌、非典型病原體感染的治療藥物得以廣泛應用，但隨著細菌對大環內酯耐藥的流行，國外研究發現，即或是M型耐藥細菌感染，大環內酯類治療失敗的機會明顯高于敏感菌；結合本研究國內釀膿鏈球菌對大環內酯類高度耐藥情況，臨床選用大環內酯類治療鏈球菌、葡萄球菌等革蘭陽性菌感染很難獲得滿意療效，臨床醫師在選用藥物時必須加以重視。

細菌耐大環內酯類erm、mef等基因大多攜帶于可傳遞耐藥遺傳物質，如質粒、轉座子等，我國釀膿鏈球菌對大環內酯類何以呈現高水平耐藥與高耐藥率、細菌耐藥與臨床用藥習慣的關系以及耐藥基因型與國外差別等值得進一步研究；另外本次試驗中發現5株耐藥的釀膿鏈球菌未檢測到三種耐藥基因，2株細菌耐藥表型與基因檢測不一致，是否存在新的耐藥基因型或者耐藥基因表達差異，亦值得進行深入研究。