【關(guān)鍵詞】 禽流感；，，，抗病毒；，，，藥物作用靶點(diǎn)

摘要： 禽流感病毒具有高致病性和高致死率，它不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的危害，而且對(duì)人類(lèi)的健康和生命安全也構(gòu)成了威脅。因此，研究抗禽流感病毒的藥物勢(shì)在必行。本文綜述了目前抗禽流感病毒藥物的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展。

關(guān)鍵詞： 禽流感； 抗病毒； 藥物作用靶點(diǎn)

Advances in antiavian influenza virus agents

ABSTRACT Avian influenza virus can causes a very high level of morbidity and mortality. It is not only greatly harmful to culturist， but also underlying dangerous to human being. Therefore it should be stressed to develop antivirus drugs. In this review， we foucus on the status and progress in research of antiavian influenza virus agents nowadays.

KEY WORDS Avian influenza virus; Antivirals; Target for drugs

1997年前，大多流感病毒學(xué)家認(rèn)為宿主的特異性會(huì)對(duì)禽流感病毒感染人群形成障礙，因?yàn)榍萘鞲胁《窘Y(jié)合于細(xì)胞表面a2，3相連的硅鋁酸受體，而人流感病毒結(jié)合于a2，6相連的硅鋁酸受體［1］。人類(lèi)呼吸道上皮細(xì)胞表面的受體大部分是a2，6型的，從而對(duì)禽流感病毒的吸附形成障礙。然而在1997年，香港發(fā)生了禽類(lèi)的H5N1毒株引起人群感染的事件。在這次感染中全部被確證的18個(gè)感染者中有6人死亡［2］，說(shuō)明這種宿主障礙是不完全的，而且這種沒(méi)有顯著攻擊性的禽類(lèi)病毒明顯比普通的人類(lèi)流感病毒致病性要強(qiáng)。從2003年到2004年，陸續(xù)有新的禽流感病毒感染人的事件報(bào)道。2003年香港有2個(gè)H5N1的病例，其中1人死亡。隨后，在荷蘭雞群的H7N7亞型禽流感病毒爆發(fā)中有80多人被感染，其中1人死亡。2004年初亞洲禽流感疫情爆發(fā)，至少有5名泰國(guó)人被證實(shí)感染禽流感而死亡。同時(shí)越南全國(guó)64個(gè)省市中有22個(gè)省市發(fā)現(xiàn)了140余名患者及疑似患者，至少25人死亡。禽流感病毒似乎已經(jīng)穿越了從禽類(lèi)到人類(lèi)由于種屬特異性而形成的天然屏障。并且，一些禽流感病毒株感染人后有較高的致死率，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了很大的威脅。鑒于禽流感病毒的危害性，其防治已成為人畜共患病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，本文就目前抗禽流感病毒藥物的研究現(xiàn)狀作一簡(jiǎn)要綜述。

1 禽流感病毒

禽流感病毒屬于A型流感病毒，根據(jù)病毒顆粒表面的兩種糖蛋白：血凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)進(jìn)一步分為不同的亞型。在A型流感病毒中已經(jīng)確定的15個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型［3］都曾在禽流感毒株中被鑒定［4］。初步研究發(fā)現(xiàn)，A型流感病毒的H2、H5、H6、H7和H9可能傳染給人類(lèi)。H5和H7亞型中的H5N1和H7N2主要以禽類(lèi)為宿主，但也可以傳染給人。H6和H9亞型雖不象H5和H7那樣有高致病性，但也不可忽視。在過(guò)去的10年里，這兩種病毒都發(fā)生過(guò)從野生的水生動(dòng)物向家養(yǎng)的禽類(lèi)傳染的事件， 并且可進(jìn)一步傳染給人［5，6］(圖1)。禽流感病毒顆粒表面HA1區(qū)的氨基酸序列是主要的抗原決定簇，從一個(gè)亞型到另一個(gè)亞型有30%左右序列的差別。禽流感病毒顆粒表面除了HA和NA以外，M2蛋白鑲嵌在病毒顆粒中但數(shù)量有限。M2蛋白是由97個(gè)氨基酸組成的同源低聚物，分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端由24個(gè)氨基酸殘基組成胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)由19個(gè)氨基酸組成疏水結(jié)構(gòu)域，C端由54個(gè)氨基酸殘基組成胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域［7］。在流行過(guò)程中，流感病毒的抗原性會(huì)發(fā)生變化。由于點(diǎn)突變而引起流感病毒的抗原性逐漸發(fā)生變異稱(chēng)為抗原漂移。由于基因重組發(fā)生的變異，則稱(chēng)為抗原轉(zhuǎn)移［3］。免疫壓力是推動(dòng)抗原漂移的主要原因。禽流感病毒也存在抗原漂移現(xiàn)象，但機(jī)率要比人流感少，可能是免疫學(xué)壓力較小的原因。抗原轉(zhuǎn)移有兩種原因，一是來(lái)自不同宿主的病毒間發(fā)生基因置換，二是由于兩個(gè)不同病毒株感染同一個(gè)細(xì)胞后發(fā)生了基因重組［3］。禽流感病毒的基因組由分子量不同的8個(gè)單鏈RNA片段組成，每個(gè)片段分別編碼不同的蛋白質(zhì)。當(dāng)兩個(gè)不同的毒株同時(shí)感染同一個(gè)細(xì)胞時(shí)，兩者的8個(gè)RNA片段即可互相重組而裝配成256個(gè)組合以上的不同子代病毒，其中大部分子代病毒可能是無(wú)致病力的，而另一些子代病毒可能比其兩個(gè)親代病毒對(duì)細(xì)胞具有更大的破壞性。在過(guò)去的幾年里，預(yù)防和治療流感的努力主要集中于兩種方法：疫苗和抗病毒藥物。對(duì)于禽流感的防治，也主要從這兩種方法入手。疫苗是減少禽流感病毒，緩解疾病癥狀和減輕并發(fā)癥的有效方法。目前的禽流感疫苗有三種類(lèi)型：全病毒疫苗、亞單位疫苗和表面抗原疫苗。疫苗的有效性主要決定于疫病流行區(qū)禽流感病毒的抗原與接種疫苗所產(chǎn)生的抗體間的匹配性。已用于人的流感疫苗的有效性還與個(gè)體因素有關(guān)，例如患者的年齡、所在疫區(qū)的時(shí)間、接種疫苗的時(shí)間等。理想的疫苗能使將近70%～90%的65歲以下的健康的成年人免于疾病［8，9］，然而當(dāng)疫病流行區(qū)的病毒種類(lèi)與疫苗產(chǎn)生的抗體不一致時(shí)，疫苗的有效性僅在50%左右。用于人類(lèi)的禽流感疫苗更面臨著特異性與安全的挑戰(zhàn)［4］。目前使用的用于禽類(lèi)的疫苗遠(yuǎn)非十全十美，它們主要還有下面幾個(gè)缺點(diǎn)：無(wú)生物降解性，能引起炎癥反應(yīng)而使接種部位硬化，有時(shí)僅能產(chǎn)生弱的免疫應(yīng)答或不能產(chǎn)生免疫應(yīng)答等［10］。而且通過(guò)增加疫苗接種量并不總是能夠增強(qiáng)免疫原性。最重要的是禽流感病毒的抗原變異，能使疫苗的有效性顯著降低。疫苗的這些不足使得抗禽流感病毒藥物的研究十分必要，它們既能起到治療作用，也能起到預(yù)防作用，從而使該病毒對(duì)人類(lèi)的威脅降到最低。

2 抗禽流感病毒藥物

2.1 離子通道抑制劑(ion channel inhibitor)目前應(yīng)用的流感病毒離子通道抑制劑有金剛烷胺(amantadine)和金剛乙胺(rimantadine)兩種。金剛烷胺是人類(lèi)第一個(gè)抗流感病毒藥物，1964年由DuPont化學(xué)公司研制成功，金剛乙胺是金剛烷胺的衍生物。金剛烷胺和金剛乙胺作用于A型流感病毒的M2蛋白［11］，通過(guò)干擾M2蛋白離子通道的活性來(lái)抑制流感病毒的復(fù)制。金剛烷胺和金剛乙胺在低濃度時(shí)對(duì)抑制H1N1，H2N2和H3N2病毒復(fù)制都有顯著的效果。M2蛋白位于病毒顆粒的表面，有固定的數(shù)量。M2蛋白的跨膜區(qū)在人流感和禽流感病毒間具有高度的保守性，均由19個(gè)氨基酸組成疏水結(jié)構(gòu)域。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，M2蛋白在流感病毒復(fù)制周期中起離子通道作用。金剛烷胺及其衍生物能有效抑制禽流感病毒H7N7的復(fù)制［12］，然而H5N1禽流感病毒的M2基因中有一個(gè)抗性位點(diǎn)，因此對(duì)離子通道蛋白抑制劑不敏感。金剛烷胺應(yīng)從感染流感病毒的48h內(nèi)開(kāi)始給藥，對(duì)于兒童每日劑量應(yīng)少于150mg，成人應(yīng)少于200mg，對(duì)于腎功能不全的患者，每日用量要小于100mg。金剛烷胺主要對(duì)肝臟有一定毒副作用。另外極為重要的一點(diǎn)是在臨床和實(shí)驗(yàn)條件下均易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性毒株，這就限制了金剛烷胺類(lèi)藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用。流感病毒對(duì)其產(chǎn)生耐藥性的原因主要是由于M2蛋白的突變引起的。

圖1 流感病毒的宿主變化圖（略）

野生的水生動(dòng)物是禽流感病毒的主要宿主，包含15個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型(H115；N19淺色標(biāo)出)。野生的水生動(dòng)物中的亞型：H5N1、H7N7、H9N2(淺色標(biāo)出)可以傳染給家養(yǎng)的動(dòng)物并進(jìn)一步傳染給人［6］。圖中黑色字體表示該種動(dòng)物作為宿主所被鑒定出的A型流感病毒。

2.2 神經(jīng)氨酸酶抑制劑(neuraminidase inhibitors)神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是禽流感病毒表面的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有唾液酸酶活性，能切割糖蛋白、糖脂和寡聚糖表面通過(guò)酮基連接的唾液酸。NA促進(jìn)新形成的病毒顆粒從感染的呼吸道粘膜向周?chē)M織擴(kuò)散，在禽流感病毒致病性中有重要作用，故NA是設(shè)計(jì)抗禽流感病毒藥物的重要靶點(diǎn)［11］。晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，NA是由相同亞基組成的四聚體。酶的活性位點(diǎn)位于各亞基表面的深穴中，均高度保守，其周?chē)且鬃儺惖目乖砦弧８鶕?jù)NA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，Vonitzstein等用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)了兩種NA的抑制劑：42氨基2Neu5Ac2ent和42胍基2Neu5Ac2en(CG167)。CG167對(duì)流感病毒的特異性增強(qiáng)，能有效抑制病毒復(fù)制。這與它能阻斷神經(jīng)氨酸酶活性，并干擾細(xì)胞間的融合有關(guān)［13］。早期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CG167感染前給藥能減輕流感癥狀；感染后給藥則縮短癥狀持續(xù)時(shí)間。目前不僅尚未發(fā)現(xiàn)它的明顯副作用，而且流感病毒對(duì)其產(chǎn)生耐藥性的頻率也較低［14］。目前，它以商品名Zanamivir進(jìn)入市場(chǎng)，用于人流感的治療，在1994～1995年北美和歐洲流感發(fā)病期間獲得了很好的效果。Zanamivir對(duì)禽流感的治療研究也在進(jìn)行，并取得一定的結(jié)果。此外，美國(guó)Gilead Science公司的科學(xué)家設(shè)計(jì)了一種新型碳環(huán)流感NA抑制劑GS4104。試驗(yàn)證實(shí)，它對(duì)流感病毒NA的親和力比對(duì)人的同類(lèi)酶大100萬(wàn)倍，是目前所發(fā)現(xiàn)的對(duì)NA特異性最高的藥物。Irina等還用實(shí)驗(yàn)證明GS4104化合物能抑制被H5N1和H9N2感染過(guò)的小鼠細(xì)胞內(nèi)病毒的增殖［15］，H5N1和H9N2是兩種直接從禽類(lèi)傳染給人類(lèi)的高致病性禽流感病毒。另有實(shí)驗(yàn)表明，NA的另一種抑制劑磺胺類(lèi)藥物在低pH值條件下抑制病毒的感染。磺胺類(lèi)藥物對(duì)流感病毒的抑制力，不僅依賴(lài)于亞型，而且依賴(lài)于宿主環(huán)境。在pH值為52時(shí)，大部分從人、豬、馬體內(nèi)分離到的流感病毒被磺胺類(lèi)藥物有效抑制，而禽流感病毒在pH值為52時(shí)對(duì)磺胺類(lèi)藥物的敏感性因NA的亞型不同表現(xiàn)各不相同，禽流感病毒N3和N6亞型同上述哺乳動(dòng)物流感病毒相似，能被磺胺類(lèi)藥物有效抑制，但N2和N8亞型，不包括H9N2病毒，在同樣的條件下仍可保持50%的活性。相反，在pH值為40時(shí)所有的禽流感病毒NA唾液酸酶的活性都能被磺胺類(lèi)藥物有效抑制［16］。

2.3 血凝集素受體結(jié)構(gòu)域阻斷劑血凝集素(HA)為流感病毒顆粒表面的另一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，在介導(dǎo)病毒感染中扮演著重要的角色，它通過(guò)結(jié)合到宿主細(xì)胞膜表面的硅鋁酸受體上，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞并且使細(xì)胞膜溶解［17～19］。HA是一個(gè)二聚體的纖突，纖突的每一個(gè)單體都包含一個(gè)球狀的能與硅鋁酸受體結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域，周?chē)鷩@著可變的抗體結(jié)合位點(diǎn)［20］，流感病毒的感染是通過(guò)病毒結(jié)合到細(xì)胞上的受體而啟動(dòng)的，因此通過(guò)阻止這種結(jié)合可以阻斷感染。利用上面提到的HA保守區(qū)域做為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)新的化合物結(jié)合到HA的受體結(jié)合區(qū)域可阻止病毒結(jié)合并感染細(xì)胞。Jeon等［21］設(shè)計(jì)的新分子aptamer能直接結(jié)合到病毒HA的受體結(jié)合區(qū)域并且最終阻止病毒與細(xì)胞的相互作用。aptamer分子是能特異性地與靶分子結(jié)合的單鏈DNA或RNA寡聚核苷酸，這種寡聚核苷酸被看作為單克隆抗體的替代物，并被認(rèn)為是惟一在診斷和治療方面均有用的藥品，可能被發(fā)展成一種新型的抗禽流感病毒藥物而應(yīng)用于臨床。

2.4 干擾RNA(siRNAs)RNAi是一種新出現(xiàn)的技術(shù)，是通過(guò)RNA特異性地抑制基因的表達(dá)。小的干擾RNA(siRNAs)是較短的(21～26nt)雙鏈RNA，抑制基因表達(dá)可能是通過(guò)誘導(dǎo)同源的mRNA序列特異性降解來(lái)實(shí)現(xiàn)［22］。許多研究表明，在體外將siRNAs導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)可以顯著地抑制特定基因的表達(dá)。同理推測(cè)RNAi能夠通過(guò)抑制病毒基因的表達(dá)來(lái)保護(hù)細(xì)胞。隨后，一些體外試驗(yàn)證明siRNA能抑制RNA病毒的復(fù)制，包括HIV病毒、polio病毒、肝炎病毒、西尼羅河病毒和流感病毒等［23，24］，新的文獻(xiàn)對(duì)siRNA對(duì)SARS冠狀病毒在細(xì)胞水平上［25］，在動(dòng)物體內(nèi)的［26］復(fù)制抑制作用作了報(bào)道。試驗(yàn)者構(gòu)建了三株克隆細(xì)胞psOa、psOe和psSk，psOa和psSk無(wú)針對(duì)SARS冠狀病毒Pol基因的siRNA，psOe有針對(duì)Pol基因的siRNA，以psNe細(xì)胞作為陰性對(duì)照，觀察感染BJ01株病毒后psOa、psOe和psSk的細(xì)胞病變情況，并對(duì)未發(fā)生細(xì)胞病變者進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，進(jìn)一步確定細(xì)胞中是否存在特異性SARS病毒抗原。病毒感染后d3的細(xì)胞病變情況為，psOa和psSk兩株細(xì)胞與陰性對(duì)照細(xì)胞psNe相比并無(wú)差別，細(xì)胞病變均為4+，無(wú)抑制病毒感染的作用，而針對(duì)Pol基因的psOe細(xì)胞病變?yōu)殛幮浴ｉg接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果為psOe細(xì)胞中無(wú)SARS病毒的特異性抗原存在。表明了針對(duì)SARS冠狀病毒Pol基因的siRNA(psOe)干擾了SARS病毒蛋白的表達(dá)。同時(shí)作者采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法對(duì)細(xì)胞上清中SARS病毒相對(duì)含量進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)為SARS病毒Pol基因的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，psOe細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒含量始終維持在較低水平，尤其在病毒感染后d5和d7，其含量?jī)H為對(duì)照細(xì)胞psNe的10-3倍。對(duì)照細(xì)胞psNe培養(yǎng)上清中病毒含量在病毒感染后24h顯著升高，并維持在較高水平。表明在psOe克隆細(xì)胞內(nèi)siRNA強(qiáng)烈地抑制了SARS病毒RNA的復(fù)制，從而干擾了病毒蛋白的表達(dá)［25］。動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中，試驗(yàn)者報(bào)道了使用siRNA預(yù)防和治療在恒河猴體內(nèi)的冠狀病毒。感染病毒的恒河猴體內(nèi)溫度是一個(gè)重要指示，不僅指示感染SARS癥狀，而且指示治療效力。試驗(yàn)者報(bào)道了每一個(gè)動(dòng)物每日體溫，并比較了所有的五個(gè)試驗(yàn)組平均體溫，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組(溫度高于391℃)所有受治療組的體溫顯著降低(低于389℃)，同時(shí)預(yù)防治療組出現(xiàn)最低溫度(387℃)，接近于正常體溫(385℃)。試驗(yàn)者還做了siRNA抑制SARS冠狀病毒在猴子呼吸系統(tǒng)中復(fù)制的試驗(yàn)。采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法對(duì)d4呼吸系統(tǒng)內(nèi)器官樣品中SARS病毒相對(duì)含量進(jìn)行了檢測(cè)，在所有感染病毒的和非特異的siRNA對(duì)照組樣本中檢測(cè)到SARS冠狀病毒，但在75%的治療組樣本中沒(méi)有檢測(cè)到SARS冠狀病毒，這個(gè)結(jié)果顯示，通過(guò)特異的siRNA可能抑制動(dòng)物體內(nèi)SARS冠狀病毒感染和復(fù)制［26］。這些試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)siRNA抗禽流感病毒的研究奠定了基礎(chǔ)。Tompkins等［27］的實(shí)驗(yàn)表明RNA干擾能有效抑制流感病毒A在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制。作者表明導(dǎo)入這些siRNA能明顯減少感染了流感病毒的小鼠肺內(nèi)的病毒滴度，保護(hù)被感染的動(dòng)物免于死亡，而且這種保護(hù)作用是特異性的。siRNA治療還對(duì)高致病性的禽流感病毒H5和H7亞型有很強(qiáng)的抑制作用，說(shuō)明siRNA有希望成為控制禽流感病毒感染的有力武器。

2.5 抗生素類(lèi)抗禽流感藥物抗生素作為抗菌藥物一直發(fā)揮著巨大的作用，它以其篩選方法成熟、資源豐富及作用機(jī)制廣泛而備受青睞。抗生素是一類(lèi)特殊的化學(xué)物質(zhì)，從總體上講，除抗腫瘤抗生素外，它們均通過(guò)選擇毒性來(lái)抑制微生物的繁殖，而不干擾宿主細(xì)胞的功能，提示我們應(yīng)對(duì)抗生素的抗病毒作用進(jìn)行探索，作為當(dāng)前抗禽流感病毒藥物的一個(gè)重要補(bǔ)充。一些具有抗病毒作用的抗生素［28］其機(jī)理已被深入研究，雖未發(fā)現(xiàn)其具有抗禽流感病毒的活性，但就其抗RNA病毒這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，可以作為一種資源進(jìn)行探索。我國(guó)學(xué)者從我國(guó)云南土壤中分離的―株放線菌產(chǎn)生的抗生素17997，后經(jīng)鑒定屬于苯安莎霉素類(lèi)抗生素，經(jīng)抗病毒藥物篩選，發(fā)現(xiàn)其有廣譜抗病毒作用［29］。在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)對(duì)單純皰疹病毒Ⅰ型、單純皰疹病毒Ⅱ型、人免疫缺陷病毒Ⅰ型、水皰性口炎病毒及柯薩奇病毒B3均有顯著抑制活性，IC50在μmol/L水平。在小鼠體內(nèi)對(duì)單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型所致皰疹性腦炎有確切治療效果，對(duì)死亡保護(hù)率和平均生存日與對(duì)照組相比有顯著差別。作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)17997作用于病毒復(fù)制早期，可顯著抑制病毒DNA的合成［30，31］，未檢測(cè)其抗禽流感病毒活性。本所研發(fā)的多肽類(lèi)抗生素1647是一個(gè)有效的抗禽流感藥物。1647是由鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其分子量約4000左右，由約30個(gè)氨基酸組成的生物活性肽。可在體外有效地滅活多種單鏈有膜RNA病毒包括禽流感病毒、流感病毒A型、冠狀病毒等，空氣噴霧可以防止病毒在空氣中傳播。

3 結(jié)語(yǔ)

目前，H5N1毒株對(duì)于離子通道類(lèi)藥物(amantadine，rimantadine)有抗性，但對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑(zanamivir)敏感。神經(jīng)氨酸酶抑制劑對(duì)A型流感病毒，包括H5N1亞型的禽流感病毒有效，但限于患者的數(shù)量尚未進(jìn)行有效的臨床試驗(yàn)［33］。新的抗禽流感病毒藥物或許會(huì)在對(duì)離子通道抑制劑、神經(jīng)氨酸酶抵制劑、血凝集素受體阻斷劑的衍生物的研制和新的抗病毒靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)中發(fā)現(xiàn)；另外，從資源豐富、種類(lèi)龐大的抗生素中尋找新的抗禽流感病毒藥物，也是一種不容忽視的途徑。

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