作者：林友文， 方圓圓， 孟曉丹

【摘要】 目的 研究殼聚糖/甘油磷酸鈉(CS/GPS)水凝膠的溫敏性及載藥凝膠緩釋性能。 方法 試管倒置法研究不同配比、不同pH對CS/GPS體系凝膠化性能的影響；紅外光譜表征CS/GPS復(fù)合物；紫外分光光度法考察溫敏凝膠相變動力學(xué)曲線，并測定載藥凝膠的累積釋放度。 結(jié)果 56% GPS與2% CS體積配比從0.2增到0.8（混合液pH 6.5），在37 ℃下凝膠化時間(GT)從10 min縮短到1.5 min；56% GPS/2% CS體積比為0.4的混合液，pH 6.5升至7.0，37 ℃下GT從120 s減少到90 s；56% GPS與 2% CS以體積配比為0.2時（混合液pH 6.9），在25 ℃時維持液相，溫度從30 ℃升至45 ℃，GT從9 min降至1 min，在37℃時，可快速凝膠化（GT為130 s）。依諾沙星為模型藥物，載藥凝膠12 h累積釋放度為62%，依諾沙星原藥3 h累積釋放度達到97%。 結(jié)論 一定配比CS/GPS體系在37 ℃具有快速凝膠化特性，溫敏性載藥凝膠對藥物具有緩釋作用。

【關(guān)鍵詞】 殼聚糖； 水凝膠類； 依諾沙星； 遲效制劑； 生物相容性材料

近年來，基于溫度敏感性的在體原位凝膠給藥系統(tǒng)成為藥劑學(xué)及生物材料領(lǐng)域研究的熱點[13]，其特點是以液體給藥后，在藥用部位因溫度變化刺激（體溫37 ℃）而發(fā)生相轉(zhuǎn)變，固化或形成凝膠，從而控制藥物的釋放?？捎糜谘鄄拷o藥、鼻腔給藥、局部注射給藥等[4]，可有效改善藥物的生物利用度，也可作組織修復(fù)植入給藥[56]。用于溫敏凝膠給藥系統(tǒng)的高聚物主要有聚N異丙烯酰胺、聚乙二醇/交酯(PEG/PLGA)嵌段共聚物、泊洛沙姆和殼聚糖（2氨基2脫氧βD葡萄糖，chitosan，CS）等[3，79]，其中CS為天然陽離子多糖，具有良好生物相溶性、可生物降解性、來源豐富等特點，在藥物控釋、智能生物材料等方面具有良好的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)CS/甘油磷酸鈉體系（Glycerphosphate，GPS）水凝膠具有溫敏性，并用于藥物控釋系統(tǒng)，但有些配方在37 ℃下凝膠化時間較長（最短的是50 min）[10]，在臨床應(yīng)用上有一定的局限性。筆者研究在37 ℃下可快速凝膠化的CS/GPS體系，并以依諾沙星為模型藥物，考察載藥凝膠的體外藥物釋放行為。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 CS（大連鑫蝶甲殼素有限公司，脫乙酰度95%，分子量50 000），GPS（美國Alfa Aesar公司），依諾沙星（福建建東藥廠，批號20061109），其他試劑均為分析純（上?；瘜W(xué)試劑公司）。

1.1.2 儀器 超級恒溫器(501型，上海實驗儀器廠有限公司)，精密pH計（pHS3B，深圳市譽達科技有限公司），恒溫振蕩器(SHAB型，南京安鐸貿(mào)易有限責(zé)任公司），可見紫外分光光度計（UV9200，南京昕航科學(xué)儀器有限公司），紅外光譜儀（Avatar 330FTIR，Thermo Nicolet公司），電子分析天平（AL104，梅特勒托利多儀器上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CS/GPS體系溫敏性實驗 2 g CS溶解在100 mL鹽酸(0.1 mol/L)溶液中，配制成的2% CS溶液，移取一定體積的2% CS溶液于試管中，按比例逐滴加入56% GPS溶液，振蕩混勻后，以少量的NaOH稀溶液（0.02 mol/L）調(diào)節(jié)混合液的pH值。放入水浴恒溫器恒溫，參照文獻[11]用試管倒置法研究GPS/CS配比、pH及溫度等條件對CS/GPS體系凝膠化性能的影響。觀察凝膠化現(xiàn)象，記錄凝膠化時間(GT)。

1.2.2 CS/GPS體系凝膠相變動力學(xué)曲線 移取一定體積的2% CS溶液于試管中，按比例逐滴加入56% GPS溶液，振蕩混勻后，以少量的NaOH稀溶液（0.02 mol/L）調(diào)節(jié)混合液pH 6.9，混合液轉(zhuǎn)入比色皿中，裝有混

3 討 論

CS是甲殼素脫乙酰基后得到的天然線性高分子，在生物醫(yī)用材料、藥物制劑方面應(yīng)用日趨廣泛[12，9]。CS內(nèi)富含氨基和羥基，可形成氫鍵，因此CS不溶于水和有機溶劑。在酸性溶液中CS上的堿性氨基能夠質(zhì)子化形成NH3+，使CS分子鏈間帶同種電荷而相互排斥，CS分子可溶于（?。┧崛芤褐?。

GPS為弱堿性化合物(pKa 6.34)，結(jié)構(gòu)中存在羥基和磷酸根負離子，是對人體安全的雙官能團陰離子偶聯(lián)劑，磷酸根負離子可與殼聚糖的質(zhì)子化氨基NH3+通過靜電引力作用交聯(lián)，使殼聚糖溶液產(chǎn)生凝膠化，形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)。凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成與環(huán)境溫度有關(guān)，凝膠機理一般是認為與凝膠中存在的靜電作用，氫鍵及親、疏水平衡有關(guān)[1，14]。

GPS與CS二者間存在著三類型的相互作用力平衡，一是CS鏈間的靜電斥力及CS與GPS的靜電引力平衡；二是氫鍵作用平衡，如CS鏈間氫鍵作用、CS與GPS間、CS與水的氫鍵作用；三是CS的疏水作用。這些相互作用力的平衡都會隨溫度的改變而改變，CS/GPS水凝膠體系從而表現(xiàn)出溫度敏感性[1]。

加入弱堿性的GPS，可部分中和殼聚糖NH3+，削弱了CS分子鏈間的靜電斥力及與水的氫鍵作用。加適量的GPS時，在低溫（25 ℃）下，因殼聚糖與水的氫鍵作用仍較強，加上GPS位阻作用，阻止了殼聚糖鏈的凝膠化交聯(lián)。但隨著溫度升高，NH3+質(zhì)子熱運動增加，弱堿性的GPS可以成功地奪取NH3+上的質(zhì)子，使CS的NH3+數(shù)量進一步下降，CS分子鏈間氫鍵作用增強，同時CS與水之間氫鍵作用減弱，疏水作用占主導(dǎo)地位，于是CS分子鏈出現(xiàn)交聯(lián)形成凝膠[15]。透光率隨溫度變化的凝膠動力學(xué)曲線顯示，在37 ℃附近透光率急劇降低，并出現(xiàn)拐點，出現(xiàn)凝膠化。凝膠化復(fù)合物的IR光譜與CS、GPS的IR譜圖比較，吸收峰的變化和位移說明二者不是簡單的物理混合，GPS與CS之間存在偶極靜電作用（磷酸根和CS的質(zhì)子化氨基）以及羥基間的氫鍵作用，也從另一方面說明凝膠機理與CS/GPS混合液存在的靜電作用，氫鍵及疏水平衡有關(guān)。

隨著GPS用量比的增加，GPS奪取更多NH3+質(zhì)子，加速CS鏈間靜電斥力減弱，使CS/GPS溶液在37℃下凝膠化時間減少，或在較低的溫度下就可以凝膠化。但用量增大到一定時（如56%GPS與2%CS等體積混合），因中和電荷、溶液堿性提高及溶解達到飽和等諸多因素使混合液中的CS沉淀析出。

顯然，pH值對凝膠化也有影響。一定的pH值范圍內(nèi)，升高CS/GPS的pH值，溶液中質(zhì)子減少，則游離氨基多，CS鏈間靜電斥力減小，分子鏈間氫鍵作用增強，使CS/GPS在37 ℃時的凝膠化時間也減少（圖2）。當(dāng)pH≥7.2時，因CS的溶解性降低而沉淀析出。而當(dāng)pH值較低時（pH<4），氨基質(zhì)子化程度高，同時抑制GPS磷酸質(zhì)子解離，CS鏈以靜電排斥占主導(dǎo)，不易交聯(lián)凝膠化。

具有溫度敏感性的給藥系統(tǒng)，載藥凝膠緩慢地、持續(xù)地釋放藥物，長時間與作用部位發(fā)生緊密接觸并吸收藥物，避開首過效應(yīng)，提高藥物的生物利用度；可減少給藥次數(shù)，延長藥物生物半衰期，增加藥物療效。

在溫度敏感性原位凝膠給藥系統(tǒng)的實際應(yīng)用中，既要求體系具有在生理溫度（37 ℃）快速凝膠化的特性，又要求在常溫（25 ℃）時保持液相制劑的穩(wěn)定。本實驗選用56% GPS/2%CS體積配比為0.2，常溫時可持續(xù)保持液相，30 min內(nèi)未出現(xiàn)凝膠化，當(dāng)溫度升高至37 ℃時，凝膠化時間為130 s，適合于載藥實驗及緩釋性能考察。結(jié)果載藥凝膠12 h累積釋放度為62%，依諾沙星原藥3 h累積釋放度達到97%，實驗結(jié)果表明CS/GPS凝膠體系對藥物依諾沙星有明顯的緩釋作用。其藥物緩釋時間較其它凝膠骨架體系對藥物的緩釋時間（數(shù)天）短，這是因為這種溫敏凝膠含水量大，具有較大的網(wǎng)絡(luò)孔道，小分子藥物較易通過凝膠網(wǎng)絡(luò)孔道擴散逸出，文獻報道小分子親水性藥物在此系統(tǒng)中數(shù)h可完全釋放[16]。此外，藥物在此凝膠系統(tǒng)的釋放速度還與藥物相對分子質(zhì)量的大小有關(guān)[2]。

本實驗中不同配比的CS/GPS體系在37 ℃時均有快速凝膠化的特性（GT為75～130 s），CS和GPS均具有良好的生物相容性，溫敏性載藥凝膠對藥物具有緩釋作用，CS/GPS是溫度敏感性給藥系統(tǒng)的理想載體。

合液的比色皿放入水浴恒溫器恒溫3 min后，取出用擦鏡紙快速擦干，參照文獻[12]分光光度法，λ450nm處測定CS/GPS混合溶液的透光率隨溫度變化，繪制凝膠相變動力學(xué)曲線。對照樣品2% CS溶液同法測定。

1.2.3 紅外光譜表征 凝膠化的CS/GPS復(fù)合物進行過濾，烘干，研磨，KBr壓片，紅外光譜檢測。

1.2.4 載藥凝膠的制備及體外藥物釋放實驗 精確稱取一定量依諾沙星于試管中，加入2% CS溶液，振蕩使藥物溶解后，逐滴加入56%GPS并混勻，37 ℃水浴加熱使其凝膠化，制成載藥凝膠。同法制備空白凝膠（不加依諾沙星）。分別配制不同濃度的依諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液， 參照文獻[13]在分光光度計測定λ262nm處測其吸光度值A(chǔ)，以濃度(C)吸光值(A)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸得到的擬合方程為:

A=0.097×C-0.0069(R2=0.999)

將一定量載藥凝膠小心地從試管中移至一端已封口的透析袋中，PBS 5 mL（pH 7.4）淋洗試管，淋洗液轉(zhuǎn)入透析袋中，并扎緊另一端封口。將透析袋放入裝有PBS（pH 7.4）195 mL的錐形瓶中。將此錐形瓶放入振蕩器中，恒溫37 ℃，調(diào)轉(zhuǎn)速100 r/min進行實驗。定時取樣3 mL（并及時補充37 ℃的PBS 3 mL，維持介質(zhì)總體積為200 mL），將各時間點的樣品以PBS為對照，在波長262 nm處測定各時間點處的吸光值A(chǔ)1。同時測定空白凝膠的吸光值A(chǔ)2，載藥凝膠中藥物吸光值A(chǔ)=A1-A2，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度C，求各時間點處載藥凝膠中藥物累積釋放度（%）。同法測定依諾沙星原料藥在相同條件下體外釋放的累積釋放度（%）。平行實驗3次，以x±s表示。

2 結(jié) 果

2.1 GPS/CS配比對凝膠化時間影響 56% GPS與2% CS體積配比從0.2增加到0.8（混合液pH 6.5），在37 ℃下GT從10 min縮短到1.5 min（圖1）。隨著GPS用量的增加，GT減少，但2%CS與56%GPS等體積混合時析出沉淀。

2.2 pH對凝膠化時間影響 56%GPS/2%CS體積比為0.4 的混合液，pH 6.5升至7.0，37 ℃下GT從120 s減少到90 s（圖2）。當(dāng)pH 7.2時因CS溶解度減小而產(chǎn)生沉淀析出。GT：凝膠化時間； GPS：甘油磷酸鈉； CS：殼聚糖.

2.3 溫度對凝膠化時間影響 不同配比56%GPS/2%CS混合液（pH 6.9）的凝膠化時間隨不同溫度而變化。溫度升高，凝膠化時間均減少，在37 ℃時均有快速凝膠化的特性（GT 為75～130 s）。體積配比為0.2的56% GPS/2% CS混合液，常溫時可持續(xù)保持液相，30 min內(nèi)未出現(xiàn)凝膠化，當(dāng)溫度升高至37 ℃時，GT為130 s。故選定該配比的CS/GPS體系為載藥實驗，考察載藥凝膠的緩釋性能（表1）。表1 溫度對殼聚糖/甘油磷酸鈉（CS/GPS）體系

2.4 凝膠相變動力學(xué)曲線 CS/GPS體系（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）的透光率隨溫度升高而變化的凝膠動力學(xué)過程（圖3）顯示，隨著溫度從20 ℃升高到30 ℃，CS/GPS體系的透光率緩慢降低，在37 ℃附近因凝膠化出現(xiàn)，透光率急劇降低，并出現(xiàn)拐點，40 ℃以后固化，透光率幾乎為0。而2% CS溶液的透光率隨著溫度從20 ℃升高到45 ℃，未見變化。圖3 殼聚糖/甘油磷酸鈉(CS/GPS)溶液（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）及2%殼聚糖(2%CS)透光率隨溫度變化曲線CS/GPS溶液（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）及2%CS透光率隨溫度變化曲線

2.5 CS/GPS復(fù)合物紅外光譜表征 凝膠化復(fù)合物的IR光譜不同于CS和GPS的IR譜圖中CH2在2 860～2 950cm-1 處的CH伸縮振動吸收峰有明顯增強（圖4），而GPS中典型的P=O伸縮振動吸收雙峰925 cm-1和950 cm-1，在復(fù)合物位的IR譜圖中位移至910 cm-1和970 cm-1出現(xiàn)。吸收峰的變化和位移說明GPS的磷酸根和CS的氨基存在偶極靜電作用，以及羥基間的氫鍵作用，而不是簡單的物理混合。

2.6 載藥凝膠的體外藥物釋放 依諾沙星原藥3 h累積釋放度達到97.7%，載藥凝膠12 h累積釋放度為62%，實驗結(jié)果表明CS/GPS凝膠體系對藥物依諾沙星有明顯的緩釋作用(圖5)。圖5 載藥凝膠與依諾沙星原藥的累積釋放曲線