【關鍵詞】 再灌注損傷； 缺血； 腎移植； 免疫抑制劑； 佐劑，免疫； 整合素類

熱、冷缺血再灌注損傷(IRI）是影響移植腎早期功能的主要因素，不僅會引起單純的移植腎功能延遲恢復(delayed graft function，DGF)，還能通過影響免疫機制促進急性排斥（acute rejection，AR）發生。同時，IRI作為一個主要的非抗原依賴性因素，其對移植腎的影響甚至超過HLA配型不合，影響移植物長期有功能存活，在移植物慢性喪失功能的發生發展中起重要作用，因此，如何減輕IRI對移植腎功能的影響是人們一直努力的方向。近年來，人們寄希望于對受者在術前、術后應用藥物或在灌洗液中加入藥物來防治移植腎IRI，以改善移植腎功能。

1 IRI導致腎臟損傷的機理 造成腎臟IRI相關因素很多，其中氧自由基過氧化損傷、凋亡、炎癥級聯反應和免疫學因素起了重要作用。

1．1 過氧化損傷 活性氧(reactive oxygen species，ROS)在IRI中起重要作用，介導整個損傷過程。ROS是外源性氧化劑或細胞內有氧代謝過程產生的具有很高生物活性的氧分子，如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)等，在IRI時大量產生。ROS可來源于線粒體電子傳遞系統、環氧化酶、脂氧化酶、內質網混合功能氧化酶和黃嘌呤氧化酶系等多條途徑。NO等含氮的復合物與O2-反應產生的過氧化亞硝酸鹽也有類似作用[1]。 血流減少和缺氧可直接導致重要營養物質缺乏和ATP生成減少，缺氧導致的線粒體功能障礙可使ATP合成進一步減少。ATP下降即可引起內皮和上皮細胞功能障礙、細胞腫脹、游離鈣離子增加和磷脂酶活性增加。在低灌流期間，腺苷和次黃嘌呤堆積。腺苷通過其對A1腺苷受體的作用能介導血管收縮；而次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成有毒性的ROS。大量產生的ROS若超過機體的清除能力，耗竭體內還原物質，即可直接損傷組織和誘導細胞凋亡，主要損傷機制如下：（1）ROS可直接與細胞膜不飽和脂肪酸和膽固醇發生脂質過氧化反應，使細胞膜的流動性下降、通透性增高，影響有酶參與的生化過程和離子泵功能。還可通過修飾氨基酸和與肽鍵反應攻擊蛋白質，導致肽鏈斷裂，使蛋白質尤其是酶蛋白喪失活性；也可直接損傷DNA分子而導致細胞凋亡。DNA雙鏈斷裂可使包括多聚ADP核糖合成酶(poly ADPribose syntherase，PARS)在內的DNA修復系統活化。PARS的功能是將煙酰胺腺苷二磷酸(NAD)上的ADP核糖單體轉運至核蛋白，其過度活化必然導致NAD缺乏，抑制內源性ATP 的產生，從而加重損傷，稱為PARS自殺，可能是氧和氮來源的ROS的直接細胞毒作用。動物實驗發現，抑制非腎臟細胞和近端小管細胞中的PARS，可顯著減輕由ROS導致的損傷。（2）ROS可作用于線粒體內膜上的氧化磷酸化過程。研究發現，線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和復合物Ⅲ是產生ROS的主要因素，氧化呼吸鏈的阻斷可導致細胞損傷和細胞凋亡[2]。 正常狀態下，機體的精細調節會自動平衡體內產生的ROS。如體內的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶等能迅速地清除ROS，防止ROS堆積。SOD酶是抵御氧自由基產生的第一道防線，但腎臟IRI會導致總SOD活性下降，使組織對氧化損傷更加敏感。因此，腎臟IRI不僅使ROS增多，還使其清除機制受到破壞，加劇了過氧化損傷。最近研究發現，導致過氧化損傷的ROS還與慢性移植物腎病相關。研究顯示，ROS可激活信號傳導級聯反應和轉錄因子，調節一系列引起細胞增殖、細胞外基質重構的基因和蛋白[3]，從而促進移植腎慢性的發生。因此，IRI初期引起的ROS表達可影響移植腎的遠期存活質量，推測這可能是移植腎早期IRI損傷影響遠期移植效果的途徑之一。 細胞內低Ca2+濃度是維持細胞正常生理功能的前提。IRI將破壞內皮細胞對Ca2+的自穩調節，使細胞內Ca2+超載，這是導致細胞損傷的關鍵。再灌注時，Ca2+與細胞質受體鈣調蛋白結合后，激活蛋白酶和磷酸酯酶A2，引起膜磷脂水解（其過程伴隨有氧自由基的產生），游離脂肪酸釋放，使細胞膜和線粒體膜的結構和骨架破壞，線粒體腫脹導致氧化磷酸化脫偶聯，使能量代謝發生障礙。鈣離子依賴性蛋白酶的激活，使黃嘌呤脫氫酶轉變為黃嘌呤脫氧酶（XO）。再灌注中大量分子O2-在XO催化下，與堆積的次黃嘌呤和黃嘌呤反應，伴隨大量氧自由基產生。過量的Ca2+還可以激活中性粒細胞，引起其“代謝爆發”，產生大量氧自由基。氧自由基可使脂質發生過氧化反應，直接損傷細胞膜，導致細胞膜通透性增加，促進新的Ca2+內流，同時氧自由基又可破壞線粒體結構，干擾氧化磷酸化過程，加速ATP等高能磷酸化合物的耗竭，使ATP依賴的離子泵活性下降，其結果也促進了細胞內Ca2+的增加。鈣超載與氧自由基的產生是導致腎IRI的重要因素，二者相互影響、協同作用，而導致IRI加重。

1.2 黏附分子的作用 在炎癥反應過程中，白細胞在血管內皮細胞表面滾動、黏附和穿越內皮移行至炎癥部位是白細胞激活和致炎的重要步驟，其分子基礎是白細胞與血管內皮表面黏附分子的相互作用及細胞因子對黏附分子表達的調節。活化的炎癥細胞和內皮細胞釋放ROS和導致腎損傷的酶類，強化細胞黏附，并激活補體系統。這些反應將進一步激活更多的炎癥細胞和實質細胞，從而形成一個逐級放大的反應網絡，即炎癥級聯反應。 黏附分子是一類介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質間黏附作用的膜表面糖蛋白。參與炎癥反應的黏附分子主要有選擇素家族（選擇素P、選擇素E、選擇素L），白細胞整合素亞家族即β2整合素（CD11a/CD18即LFA1、CD11b/CD18即Mac1、CD11c/CD18即p150，95）和免疫球蛋白超家族(ICAM1、ICAM2、ICAM3、VCAM1)[4]。 選擇素家族中，選擇素L可表達于中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞表面，選擇素P通常儲存于內皮細胞和血小板的分泌顆粒中，在受炎癥刺激后數分鐘內可表達于細胞及血小板表面。選擇素L、選擇素P可通過相應的配體相互作用，介導起始粘附及滾動作用。選擇素E受細胞因子刺激后數小時在內皮細胞表面表達達高峰，可錨定在細胞表面繼而介導其活化，有助于白細胞穩定地粘附于內皮細胞[5]。 整合素中，β2整合素僅限于白細胞上表達，內皮細胞表達的細胞間黏附分子ICAM1、ICAM2、ICAM3及血管細胞黏附分子VCAM1為其配體。作為免疫球蛋白超家族中黏附分子受體之一，ICAM1似乎是早期移植物失功的重要介質，因為其表達具可誘導性，而且是白細胞黏附分子受體中唯一能使中性粒細胞趨化至缺血后組織內的分子。ICAM1組成性低表達于內皮細胞表面，但其表達可因缺血或過氧化損傷而上調，且在熱缺血再灌注后上調表達尤為明顯。針對ICAM1的反義寡聚脫氧核苷酸可有效抑制IRI所致的組織損傷[6]。

1.3 細胞因子的作用 缺血時組織局部炎癥介質的產生也將增加，包括TNFα、IL1、補體活化產物、PAF、花生四烯酸的代謝產物及活性氧代謝物等，它們均可使黏附分子表達增強。最近發現，可催化花生四烯酸代謝中關鍵酶反應的COX2的表達與腎IRI損傷密切相關。TNFα與組織IRI過氧化損傷也密切相關[7]。 IL1和TNFα等炎性細胞因子可使選擇素表達上調。TNFα利用蛋白激酶C依賴和非依賴途徑激活NFκB， 加速細胞黏附分子的轉錄。研究證實，腎臟缺血30 min后TNFα mRNA 即表達增強。再灌注后、白細胞浸潤之前，TNFα水平和生物學活性均增加。而TNFα結合蛋白則可降低TNFα生物活性、減少中性粒細胞浸潤、保護腎臟功能，表明局部合成的TNFα是腎臟IRI早期重要的致病因子[8]。此外，阻斷TNFα或IL1的產生可減少ICAM1的表達并減輕IRI。 此外，IRI雖為重要的非免疫學因素，但越來越多的證據表明，它可和免疫學因素相互影響，增強其作用。因此，研究與IRI相關的免疫學因素成為一個重要的方向，有助于深入了解IRI的損傷機理和效應機制。

2 移植腎IRI的藥物防治研究

2.1 抗氧化劑 氧自由基清除劑和鈣離子拮抗劑經臨床應用后已證實對腎IRI有一定防治作用。抗氧化劑包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、甘露醇、別嘌吟醇、維生素E、N乙酰半胱氨酸、鐵螯合劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、鈣通道阻滯劑、巰基還原劑、自由基自旋捕集劑，DMPO和TEMPO等。低分子化合物VitC、VitE、輔酶Q是一些天然抗氧化劑，大多為體內氧化還原反應的輔酶，可通過不同途徑阻斷脂質過氧化[9]。卵磷脂化的超氧化物歧化酶(lecithinized superoxide dismutase，lecSOD)是一種新型自由基清除劑，與內皮細胞有較高親和力，能明顯抑制中性粒細胞黏附于內皮細胞，而未修飾的重組新細胞個體SOD則無此作用。提示lecSOD有助于保護內皮細胞對抗IRI。Nakagawa等證實了利用超氧化物歧化酶對自由基的清除作用可以減輕腎移植中IRI，改善移植腎的長期存活[10]。褪黑素是松果體合成、分泌的神經內分泌激素，是迄今為止已知抗氧化作用最強的自由基清除。它能中和ROS，直接發揮其抗氧化作用，還可抑制NO合成酶的活性，從而減少了ROS的產生，起到間接抗氧化作用。Yokozawa等發現，甘草根提取物也可防治過氧化損傷[11]。研究發現，脫氫表雄酮和柚甙也能顯著減輕腎組織IRI的過氧化損傷。Li Volti等研究發現，血紅素加氧酶（Heme oxygenase，HO）能催化十因子為一氧化碳和膽紅素/膽綠素，促進鐵離子的釋放。他們認為，對于腎臟IRI，外用一氧化碳和膽紅素/膽綠素可以刺激HO通路，通過作用于靶基因起到保護腎臟的作用[12]。De Araujo等認為，抗氧化劑N乙酰半胱氨酸可以減少巨噬細胞和淋巴細胞的浸潤，保護腎小管免受IRI[13]。Cicalese等發現，丙酮酸可直接抑制過氧化氫產生，并間接增加抗氧化劑即還原型谷胱甘肽的含量，進而增加谷胱甘肽抗氧化系統的能力[14]。丙酮酸可抑制黏膜組織的損傷、嗜中性粒細胞的浸潤以及自由基的生成，從而保護腎臟免受IRI。

2.2 抗炎藥物 鑒于炎癥反應在IRI中的作用，人們試圖從抑制炎癥反應的角度探索防治腎IRI的措施。因為參與炎癥級聯反應的因素交叉重疊，所以阻斷單一因素不可能減輕腎損傷，徹底消除炎癥級聯反應才能阻止和治療腎IRI損傷。許多實驗都著眼于抑制炎癥介質的釋放，干擾炎癥介質與受體的結合，抑制白細胞黏附分子合成及與內皮細胞的粘附。在腎IRI中，白細胞粘附首先由E選擇素和P選擇素介導，二者對其受體PSGL1具有很高的親和力。P選擇素是不需經過轉錄、在再灌注后5 min 就從內皮細胞的weibepalade小體直接轉導至內皮細胞表面的一種黏附分子，最早介導內皮細胞與白細胞的粘附，被認為是腎IRI后炎癥反應的始動環節。Takada等在腎冷IRI大鼠模型上將一種可溶性的P選擇素糖蛋白配體(sPSGL )加入到冷灌洗液中，以阻斷P選擇素的作用，再灌注后3 h又靜脈注射sPSGL以阻斷E選擇素的表達，結果治療組E選擇素的mRNA表達水平明顯降低，白細胞浸潤減半；腎組織中CD4細胞、巨噬細胞、MHCⅡ陽性細胞數明顯減少，與T細胞、巨噬細胞相關的細胞因子、黏附分子、生長因子的mRNA表達水平亦明顯降低，腎功能、結構均得到明顯改善。不僅如此，經過早期治療的大鼠其遠期腎功能亦得到明顯改善[15]。應用PAF受體拮抗劑、內皮素受體拮抗劑、抗ICAM1抗體等減輕IRI前后的炎癥浸潤，也顯示了減輕IRI的作用。 Subramanian等研究了甘草酸（HES）對腎IRI的影響，證明其可以減輕兔模型的腎IRI，改善腎功能。因而推測HES可能通過抑制E和P選擇素發揮作用[16]。Hofbauer等證明，在體外使用臨床濃度的HES可使粒細胞通過內皮細胞層的化學趨化作用減弱[17]。Dieterich等在做內皮細胞培養時也證明，HES可使炎癥反應中介導白細胞和內皮細胞間相互作用的黏附分子下調，包括ICAM1。HES減少白細胞在小動脈和小靜脈的粘附而沒有明顯影響白細胞滾動，其抗炎作用可能是主要抑制β2整合素或IgG超家族黏附分子[18]。Hoffmann等的研究表明，HES(130 kD) 對內毒素誘發的微循環障礙有保護作用，可明顯下調小動脈和小靜脈的白細胞粘附增多，而相應量的晶體溶液（等滲鹽水）則不產生這樣的保護作用[19]。 此外，我國中藥如川芎嗪、銀杏葉、益生注射液、燈盞細辛制劑、洋金花注射液等是當前植物藥開發研究熱點之一。這些藥物可通過改善腎微循環、清除自由基、抗炎等機制實現其保護作用[20]。因此，從我國天然藥物資源中尋找價廉、高效、低毒、能與免疫抑制劑協同作用的IRI拮抗藥物，是極具潛力的防治策略之一。

2 移植腎IRI的藥物防治研究

2.1 抗氧化劑 氧自由基清除劑和鈣離子拮抗劑經臨床應用后已證實對腎IRI有一定防治作用。抗氧化劑包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、甘露醇、別嘌吟醇、維生素E、N乙酰半胱氨酸、鐵螯合劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、鈣通道阻滯劑、巰基還原劑、自由基自旋捕集劑，DMPO和TEMPO等。低分子化合物VitC、VitE、輔酶Q是一些天然抗氧化劑，大多為體內氧化還原反應的輔酶，可通過不同途徑阻斷脂質過氧化[9]。卵磷脂化的超氧化物歧化酶(lecithinized superoxide dismutase，lecSOD)是一種新型自由基清除劑，與內皮細胞有較高親和力，能明顯抑制中性粒細胞黏附于內皮細胞，而未修飾的重組新細胞個體SOD則無此作用。提示lecSOD有助于保護內皮細胞對抗IRI。Nakagawa等證實了利用超氧化物歧化酶對自由基的清除作用可以減輕腎移植中IRI，改善移植腎的長期存活[10]。褪黑素是松果體合成、分泌的神經內分泌激素，是迄今為止已知抗氧化作用最強的自由基清除。它能中和ROS，直接發揮其抗氧化作用，還可抑制NO合成酶的活性，從而減少了ROS的產生，起到間接抗氧化作用。Yokozawa等發現，甘草根提取物也可防治過氧化損傷[11]。研究發現，脫氫表雄酮和柚甙也能顯著減輕腎組織IRI的過氧化損傷。Li Volti等研究發現，血紅素加氧酶（Heme oxygenase，HO）能催化十因子為一氧化碳和膽紅素/膽綠素，促進鐵離子的釋放。他們認為，對于腎臟IRI，外用一氧化碳和膽紅素/膽綠素可以刺激HO通路，通過作用于靶基因起到保護腎臟的作用[12]。De Araujo等認為，抗氧化劑N乙酰半胱氨酸可以減少巨噬細胞和淋巴細胞的浸潤，保護腎小管免受IRI[13]。Cicalese等發現，丙酮酸可直接抑制過氧化氫產生，并間接增加抗氧化劑即還原型谷胱甘肽的含量，進而增加谷胱甘肽抗氧化系統的能力[14]。丙酮酸可抑制黏膜組織的損傷、嗜中性粒細胞的浸潤以及自由基的生成，從而保護腎臟免受IRI。

2.2 抗炎藥物 鑒于炎癥反應在IRI中的作用，人們試圖從抑制炎癥反應的角度探索防治腎IRI的措施。因為參與炎癥級聯反應的因素交叉重疊，所以阻斷單一因素不可能減輕腎損傷，徹底消除炎癥級聯反應才能阻止和治療腎IRI損傷。許多實驗都著眼于抑制炎癥介質的釋放，干擾炎癥介質與受體的結合，抑制白細胞黏附分子合成及與內皮細胞的粘附。在腎IRI中，白細胞粘附首先由E選擇素和P選擇素介導，二者對其受體PSGL1具有很高的親和力。P選擇素是不需經過轉錄、在再灌注后5 min 就從內皮細胞的weibepalade小體直接轉導至內皮細胞表面的一種黏附分子，最早介導內皮細胞與白細胞的粘附，被認為是腎IRI后炎癥反應的始動環節。Takada等在腎冷IRI大鼠模型上將一種可溶性的P選擇素糖蛋白配體(sPSGL )加入到冷灌洗液中，以阻斷P選擇素的作用，再灌注后3 h又靜脈注射sPSGL以阻斷E選擇素的表達，結果治療組E選擇素的mRNA表達水平明顯降低，白細胞浸潤減半；腎組織中CD4細胞、巨噬細胞、MHCⅡ陽性細胞數明顯減少，與T細胞、巨噬細胞相關的細胞因子、黏附分子、生長因子的mRNA表達水平亦明顯降低，腎功能、結構均得到明顯改善。不僅如此，經過早期治療的大鼠其遠期腎功能亦得到明顯改善[15]。應用PAF受體拮抗劑、內皮素受體拮抗劑、抗ICAM1抗體等減輕IRI前后的炎癥浸潤，也顯示了減輕IRI的作用。 Subramanian等研究了甘草酸（HES）對腎IRI的影響，證明其可以減輕兔模型的腎IRI，改善腎功能。因而推測HES可能通過抑制E和P選擇素發揮作用[16]。Hofbauer等證明，在體外使用臨床濃度的HES可使粒細胞通過內皮細胞層的化學趨化作用減弱[17]。Dieterich等在做內皮細胞培養時也證明，HES可使炎癥反應中介導白細胞和內皮細胞間相互作用的黏附分子下調，包括ICAM1。HES減少白細胞在小動脈和小靜脈的粘附而沒有明顯影響白細胞滾動，其抗炎作用可能是主要抑制β2整合素或IgG超家族黏附分子[18]。Hoffmann等的研究表明，HES(130 kD) 對內毒素誘發的微循環障礙有保護作用，可明顯下調小動脈和小靜脈的白細胞粘附增多，而相應量的晶體溶液（等滲鹽水）則不產生這樣的保護作用[19]。 此外，我國中藥如川芎嗪、銀杏葉、益生注射液、燈盞細辛制劑、洋金花注射液等是當前植物藥開發研究熱點之一。這些藥物可通過改善腎微循環、清除自由基、抗炎等機制實現其保護作用[20]。因此，從我國天然藥物資源中尋找價廉、高效、低毒、能與免疫抑制劑協同作用的IRI拮抗藥物，是極具潛力的防治策略之一。