作者：張典，袁秉祥，鄧秀玲，楊廣德，賀浪沖

【摘要】 目的 增加細胞膜色譜法的適用范圍，構建血管內皮細胞細胞膜固定相，研究藥物與血管內皮細胞膜上受體的生物親和作用。方法 培養血管內皮細胞細胞株，制備細胞膜固定相，應用細胞膜色譜法研究九種藥物與受體的親和力。結果 九種不同的配體與受體的親和順序為：S(+)QNB、哌唑嗪、R(-)QNB、阿托品、育亨賓、BMY7378、(±)美托洛爾、山莨菪堿、東莨菪堿。其容量因子分別為：14.289、13.667、11.121、6.794、4.758、4.386、3.926、2.424、2.412。結論 血管內皮細胞膜色譜模型具有高度穩定性，可試用于藥物的高效初篩。

【關鍵詞】 細胞膜 色譜 血管內皮細胞

ABSTRACT: Objective To extend the application of cell membrane chromatography (CMC)， the cell membrane stationary phase (CMSP) with human umbilical vein endothelial cell (EVC304) are constructed. The chromatography affinity of drugs to receptors of EVC304 is investigated. Methods We cultured EVC304 strain and constructed EVC304 CMSP. The bioaffinity of nine drugs to receptors was investigated per CMC method. Results The affinity rank order of receptors obtained from CMC for the nine ligands was as follows: S(+)QNB， prazosion， R(-)QNB， atropine， yohimbine， BMY7378， metoprolol， 6542， and scopolamine. The related kvalues were 14.289， 13.667， 11.121， 6.794， 4.758， 4.386， 3.926， 2.424， and 2.412. Conclusion The EVC304 expressed CMSP has high stability and can be used to speed up the initial screening.

KEY WORDS: cell membrane; chromatography; vascular endothelial cell

細胞膜色譜法(cell membrane chromatography， CMC)是以固定在硅膠表面的細胞膜為固定相，通過藥物在固定相上的色譜行為有效地將藥物的體內過程在體外進行模擬[13]。此法已被證明可用于研究藥物與受體的相互作用和中草藥中生物活性成分的篩選[46]。但是，用CMC法研究受體和篩選藥物時，有時所需標本量太少并難以收集，還不能進行血管內皮細胞等散在分布細胞的研究和藥物的篩選。為了增加CMC法的應用范圍，本實驗將CMC法與細胞生物學方法相結合，用人臍靜脈血管內皮細胞ECV304制備細胞膜固定相(cell membrane stationary phase， CMSP)，建立了血管內皮細胞膜色譜模型，用CMC法首次研究了9種配體與內皮細胞上受體的生物親和作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞

來源于人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC)的人血管內皮細胞株EVC304，由中國科學院上海細胞研究所提供。

1.1.2 藥品

阿托品(Atropine，分子量289.4)購自上海化學試劑采購供應站；R(-)QNB(分子量337.38)、S(+)QNB(分子量337.38)均購自RBI公司；東莨菪堿(Scopolamine，分子量384.3)、育亨賓(Youhimbin，分子量390.9)、BMY7378(分子量458.4)、哌唑嗪(Prazosin，分子量419.9)、(±)美托洛爾(Metoprolol，分子量267.38)均購自Sigma公司；山莨菪堿(6542，分子量386.29)購自山西晉西雙鶴藥業。

1.1.3 主要試劑

DMEM干粉培養基(GIBCO公司)、小牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、NaCl、鹽酸(HCl)、磷酸(H3PO4)、乙醇(C2H5OH)等均為國產分析純。

1.1.4 主要儀器

Gilson高效液相色譜系統，包括510泵、486型紫外檢測器、7125型手動進樣閥(美國Rheodyne)和Anastar色譜工作站(天津奧泰科技有限公司)；410型低溫冷凍高速離心機(德國HERMLEZK)；AS5150A超聲振蕩儀(美國Auto science)；PHS2D型酸度計(上海第二分析儀器廠)；TB85型循環水浴(日本SHIMADZU)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

來源于人血管內皮細胞株ECV304，在37℃、50mL/L CO2及飽和濕度條件下，培養于含100mL/L小牛血清DMEM培養基中，常規傳代[7]。

1.2.2 EVC304細胞膜的制備

當8個培養瓶(75cm2)的內皮細胞覆蓋瓶底90%時，將其中4瓶做細胞膜。另外4瓶細胞凍存于液氮罐中保存。制膜方法：2.5g/L胰蛋白酶液消化，1000×g離心10min，棄上清，加入10mL低滲液，超聲振蕩20min，450×g離心20min，取上清液，16000×g離心20min，取沉淀為ECV304細胞膜，上述操作在4℃下進行。

1.2.3 EVC304細胞膜色譜柱的制備

取活化硅膠(5μm)0.3g，加入上述制備的ECV304細胞膜，4℃振蕩60min，平衡后離心分離，沉淀物用0.6mL TrisHCl洗滌后，為ECV304細胞膜固定相。由藥學系天然藥物研究與工程中心提供。比較兩個同種細胞膜色譜柱的穩定性。

1.2.4 9種配體對EVC304細胞膜CMC的研究

柱溫為37℃；流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4)，pH＝7.4；流速為0.5mL/min；色譜柱需用流動相平衡3～4h，基線穩定后，分別進樣分析；紫外檢測波長為220～270nm(根據每種藥物實測情況定)；靈敏度(AUFS)為0.2。

1.3 統計學處理

用Prim軟件對藥物在兩個CMSP上的容量因子(K＇)進行相關性分析，取檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 內皮細胞形態學觀察

倒置顯微鏡下可見培養的單層生長的內皮細胞為長梭型，邊界清楚，胞漿豐富，核圓形或橢圓形，核仁1～2個。人臍靜脈內皮細胞生長到融合狀態時，呈“鋪路石”狀排列。

2.2 9種藥物的CMC研究結果

將EVC304細胞膜色譜柱用50mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡3～4h后，根據九種藥物紫外檢測波長測定結果(220～270nm)分別進樣分析。其中山莨菪堿(6542)為注射用針劑，規格為10g/L，用三蒸水配成濃度為3×10-3mol/L。其余藥品均為白色固體粉末，用甲醇溶解，濃度均為3×10-3mol/L。計算不同藥物在內皮細胞色譜柱上的容量因子K＇(表1)。藥物在另一個EVC304細胞膜色譜柱上的親和力研究方法同上(表2)。表1 藥物在第一個EVC304細胞膜CMSP上的色譜作用參數（略）表2 藥物在第二個EVC304細胞膜CMSP上的色譜作用參數（略） 不同mAchR、αAR、βAR阻滯劑在第一個內皮細胞CMSP上親和力順序由大到小為：S(＋)QNB、哌唑嗪、R(－)QNB、阿托品、育亨賓、BMY7378、(±)美托洛爾、山莨菪堿、東莨菪堿。其容量因子分別為：14.289、13.667、11.121、6.794、4.758、4.386、3.926、2.424、2.412。藥物在第二個EVC304CMSP上親和力順序由大到小為：哌唑嗪、S(＋)QNB、R(-)QNB、阿托品、育亨賓、BMY7378、(±)美托洛爾、東莨菪堿、山莨菪堿。其容量因子分別為：10.734、9.398、9.177、7.964、5.585、5.369、4.061、2.931、2.472。

2.3 藥物在兩個CMSP上的容量因子(K＇)相關性分析 根據同種藥物在兩個EVC304細胞膜色譜柱上容量因子的檢測結果，用Prim軟件進行相關性分析，結果表明藥物在兩個同種色譜柱的容量因子之間存在正相關關系(r=0.966)，且差異具有顯著性意義(P<0.01，圖1)。

3 討 論 人臍靜脈作為培養內皮細胞的材料來源，具有取材方便，且能使實驗結果更接近人體內皮細胞生長等優點。經體外培養的人臍靜脈內皮細胞，不僅在形態和功能上與體細胞相似，還能在數量上呈幾何級數增加，這為研究與內皮細胞有關的基礎及臨床醫學課題提供了理想的細胞模型。本次實驗首次研究了9種藥物在內皮細胞CMSP上的保留情況。ECV304是由人臍靜脈內皮細胞轉化的細胞系，可以表達內皮細胞標志如WeibelPalada小體、纖溶酶原激活物(plasmiaogen activator， PA)等，它可以進行穩定傳代培養，是原代內皮細胞培養的良好模型。 在實驗過程中，為保證比較結果的可靠性，要做到：①細胞膜制備方法保持一致。細胞膜制備在0～4℃進行，制備好后立即使用。②培養細胞的數量盡可能保持一致。兩個CMC色譜柱所用的細胞膜均來自4瓶培養細胞(75cm2)。③實驗條件要保持一致。本次實驗流動相均選擇37℃，50mmol/L，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。因為隨著流動相濃度的增加，洗脫能力增加，藥物的保留時間縮短，容量因子減小。條件不一致數據沒有可比性。 實驗選用的藥物有mAchR拮抗劑：阿托品、山莨菪堿(6542)、東莨菪堿和QNB。QNB是目前最強的毒蕈堿受體拮抗劑，是理想的M膽堿受體鑒定工具藥。哌唑嗪和BMY7378是α1AR拮抗劑；育亨賓是α2AR拮抗劑；美托洛爾是βAR拮抗劑。實驗藥物在第一次制備的內皮細胞CMSP上的容量因子與第二次實驗結果略有不同，原因是所用的高效液相色譜儀僅有一臺，不能同時研究兩個色譜柱。第二次所用細胞經過液氮罐凍存，細胞有損失，使得藥物在色譜柱上的保留時間縮短。但藥物在兩個內皮細胞CMSP上的容量因子之間存在正相關關系(r=0.966， P<0.01)。 本次實驗也證明了EVC304上存在M受體、α1AR、α2AR、βAR，其中βAR數目相對較少。用培養細胞制備CMSP后色譜柱的手性識別能力并沒有提高，左旋和右旋QNB在色譜柱上的保留時間相差1min左右，消旋體美托洛爾沒有被分開。隨著CMC研究工作的一步步深入，其應用范圍將逐步擴大，使之更符合藥物作用的體內過程。CMC法將以快速、高效等特點成為受體研究和中草藥篩選的新方法。