作者：羅國剛，雷莉，呂社民，樊文靜，徐倉寶

【摘要】 目的 頸動脈血降鈣素基因相關肽水平升高是引發血管性頭痛發作的重要原因之一，本研究探討血管性頭痛的發生機制和藥物作用靶點的理想體外模型。方法 SD大鼠三叉神經節在無血清DMEM培養液中離體培養12、24、48h后免疫組化方法比較降鈣素基因相關肽(CGRP)陽性細胞數表達水平，實時定量PCR法(real timePCR)確定CGRPmRNA表達水平的變化。結果 大鼠三叉神經節離體培養24h后CGRP的免疫陽性表達細胞數明顯增高，CGRPmRNA表達水平也較新鮮組明顯增高(P均<0.05)。結論 大鼠三叉神經節離體培養后能精確模擬體內血管性頭痛發作期CGRP的變化，是研究血管性頭痛發生機制和開發藥物作用靶點的理想體外模型。

【關鍵詞】 三叉神經節；離體培養；降鈣素基因相關肽；體外模型

ABSTRACT: Objective To explore an ideal model for primary vascular headache in studying pathogenesis and new medication therapeutic target in vitro. Methods Trigeminal ganglion (TG) of SD rats was isolated and cultured in serumfree DMEM medium for 12h， 24h and 48h. Then the calcitonin generelated peptide (CGRP) positive stained cells were detected by using immunohistochemistry staining， and realtime polymerase chain reaction (RTPCR) was used to determine mRNA expression changes of CGRP. Results The TG cultured in serumfree DMEM for 24h had a significant increase in the CGRPpositive stained cell number and upregulated strikingly CGRPmRNA expression compared with fresh TG (P<0.05). Conclusion The TG after explant culture with serumfree medium exactly simulates the pivotal change in primary vascular headache attack， which always manifests the increased release of neuropeptides， such as CGRP. Therefore， explant culture of rat TG is an ideal model in vitro for studying pathogenesis and new therapeutic target primary vascular headache.

KEY WORDS: trigeminal ganglion; explant culture; calcitonin generelated peptide; in vitro model

血管性頭痛人群發病率約16%～20%[1]，在全球造成的經濟負擔重于腦血管病。血管性頭痛急性發作時三叉神經血管系統激活，三叉神經節逆向釋放以降鈣素基因相關肽(calcitonin generelated peptide， CGRP)為代表的血管活性肽類物質明顯增多，當 CGRP釋放降至基線水平時頭痛緩解[24]。未來10年治療偏頭痛最有效、最安全、最持久的藥物將是CGRP拮抗劑[56]。目前，研究血管性頭痛發病機制的動物模型有血管源性機制模型、三叉神經節刺激模型、硬腦膜神經源性炎癥模型、皮層擴布性抑制(CSD)模型、CACNA1A、ATP1A2和SCN1基因相關模型等[79]。但是，以上動物模型都不能精確模擬出頭痛急性發作時CGRP的變化規律，也不利于開發藥物作用的新靶點。本研究把大鼠三叉神經節離體后在無血清的DMEM培養液中培養一定時間觀察以CGRP為代表的血管活性肽類物質的變化規律，旨在尋求一種血管性頭痛發生機制和開發藥物作用新靶點理想的體外研究模型。

1 材料與方法

1.1 大鼠三叉神經節離體培養模型的建立

成年雄性SpragueDawley(SD)大鼠，SPF級，體重250～300g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。戊巴比妥鈉腹腔內注射(40mg/kg，必要時追加劑量)麻醉后在750mL/L酒精中浸泡消毒3min，斷頭處死用止血鉗沿枕骨大孔處逐層剝開顱骨、顳骨，刮掉大腦小腦暴露三叉神經，輕輕剪斷三個感覺根取出神經節，在冷的PBS(phosphate buffer saline， PBS)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中剔除神經節周圍的血管、脂肪、神經鞘膜等結締組織后，成乳白色為止，置入4℃ PBS液中保存備用。24孔培養板內每孔盛2mL DMEM(Dulbeccos modified eagles medium. Sigma， USA)培養液(加青霉素100u/mL和鏈霉素100mg/L以及兩性霉素B 25mg/L)。37℃恒溫培養箱中培養，持續通以含50mL/L CO2的O2使pH值保持在7.4左右，每24h更換培養液1次。

1.2 免疫組化法測定三叉神經節內CGRP陽性細胞數

離體培養24h后的三叉神經節浸入含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L PBS磷酸緩沖液過夜。所有三叉神經節用振動切片機冠狀位上均勻切成30μm厚度的切片，組織切片都收集在含3mL/L Triton X100(PBST)和30mL/L過氧化氫PBS液中，用1mL/L牛血清白蛋白封閉抗體1h，然后與兔多克隆CGRP抗體(Sigma，USA，1∶2500稀釋)4℃下共同孵育72h后，再用PBST沖洗，接著用含生物素的羊抗兔IgG抗體(vector laboratories，1∶2000稀釋)4℃下攪拌孵育過夜。進一步漂洗2次后，組織切片置于1∶1000親和生物素復合物(vector laboratories)稀釋液中2h。PBS沖洗，4min×3次；DAB顯色(Sigma)；最后組織切片用Tris鹽酸緩沖液漂洗后置于凝膠載玻片上，加蓋玻片前用中性紅復染。由另一研究者雙盲法普通光鏡觀察，然后熒光顯微鏡(Olympus)觀察，采用SCIONIMAGE圖像分析軟件撲捉所有原始圖像，256階灰度反轉亮度，細胞光密度測量時圖像放大10倍分析圖像。CGRP陽性反應細胞數、平均光密度和累積光密度測量和計算都用百分比。圖像分析時剔除染色不均、皺褶或淚滴樣圖像。雙向方差分析法Scheffe′比較各組CGRP陽性反應細胞百分比，顯著性檢驗概率取P<0.05。

1.3 實時定量RTPCR測定mRNA表達水平的變化

離體培養的三叉神經節用FastPrepA試劑盒(QBIOgene，CA，USA)中1mL RNA proTM液(QBIOgene，CA，USA)勻漿處理，按程序提取總RNA。cDNA的逆轉錄采用Gene Amp RT試劑盒(PE Applied Biosystems)，PerkinElmer 2400 PCR擴增儀擴增42次30min。RTPCR采用GeneAmp SYBR Green PCR試劑盒(PE Applied Biosystems)，PerkinElmer PCR儀(PE， GeneAmp 5700)。引物序列根據基因數據庫，應用引物表達2軟件設計，CGRP(M34090)前引物Forward：5′GAGGCAGCTACAAGGTTCAGG3′，后引物Reverse：5′AGGTGTTGGTGCTGGACACA3′；大鼠PACAP前引物Forward：5′ACTCTGTCTTCTACATCTCTCTCCTCG3′，后引物Reverse：5′AGGGAGCGTGACACCGAA3′；大鼠nociceptin前引物Forward：5′：AGTGAGTTTATGAGGCAGTACCTG3′，后引物Reverse：5′GCGTTGGCTTGACTGCATG3′。管家基因(house keeping gene)分別以GAPDH(前引物：5′GGCCTTCCGTGTCCTACC3′，后引物：5′CGGCATGTCAGATCCACAAC3′)和βactin(前引物：5′CTATCGGCAATGAGCGGTTCC3′，后引物：5′TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG3′)作為內對照。PCR反應體系為50μL，開始50℃ 2min，95℃ 10min，然后在95℃ 15s和60℃ 1min循環40次，反應結束后采用分離曲線分析法確定反應產物的特異性。數據定量分析采用PCR循環閾值CT (cycle threshold，CT)比較法，以GAPDH的CT 值為內對照，計算CGRP、垂體腺苷酸環化酶激活的多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptides， PACAP)和鎮痛素(nociceptin)等物質mRNA的相對表達量。標準曲線根據CT=lg[濃度/(1+E)]方程繪制，E代表擴增效率，是根據標準曲線的斜率計算而得，理想斜率為3.3，理想擴增效率為100%。標準曲線驗證CGRP和GAPDH的cDNA在PCR反應體系中擴增效率相同[12]。統計分析采用配對t檢驗，顯著性概率取P<0.05。

1.4 統計分析

計量資料以均數±標準差(±s)表示。應用GraphPad Prism (version 4.0)統計軟件，Oneway方差分析，方差分析前先做正態性檢驗和方差齊性檢驗，所有資料都符合正態分布但部分資料方差不齊，故采用方差分析Dunnetts點檢驗和Welchs校正后非配對的t檢驗，檢驗的顯著性水準取P<0.05。

2 結 果

2.1 大鼠三叉神經節離體培養后血管活性肽mRNA表達水平的變化

大鼠三叉神經節離體培養后血管活性肽類CGRP、PACAP 和nociceptin的mRNA 相對表達量較新鮮組明顯增高(P<0.05或P<0.01，圖1)。再以βactin作為內對照，觀察CGRPmRNA相對表達量的變化(圖2)。

2.2 大鼠三叉神經節CGRP免疫陽性細胞表達的變化

免疫組化染色顯示新鮮的和離體培養后的三叉神經節內都有CGRP免疫反應陽性細胞表達，但在新鮮組表達量很低，而離體培養后12、24、48h后CGRP陽性反應細胞數表達水平顯著增高(P<0.05或<0.001)，培養12h的陽性細胞數最多(圖3白空心箭頭所示，黑實心箭頭所示為CGRP免疫反應陰性細胞)。由圖3可見CGRP主要表達在三叉神經節內中小型神經元，CGRP陽性細胞呈棕褐色，胞體染色深淺不一，部分細胞中心部位著色淺，周圍胞漿點狀著色，似菊花樣，部分細胞漿內染色致密均勻，中心部位略淡，胞體圓形、卵圓形及不規則形，染色深淺與胞體大小無關。

2.3 三叉神經節離體培養后CGRP免疫組化切片的圖像分析

對大鼠三叉神經節離體培養后CGRP免疫組化切片圖像進一步分析，結果顯示CGRP陽性反應細胞數的百分比、表達面積、平均熒光光密度和累積光密度值(IOD)都顯著高于新鮮未培養組(P<0.05，圖4)。

3 討 論

常見的血管性頭痛包括偏頭痛、叢集性頭痛和慢性反復發作性頭痛等，累積人群發病率約25%～40%。據WHO統計血管性頭痛是全球致殘性和造成經濟負擔前二十位疾病之一。血管性頭痛具體的發病機制目前并不十分清楚，有血管源性學說、神經源性學說、三叉神經血管系統激活學說、5羥色胺及受體活化學說等[1，1011]。但是，有一個現象是大家公認的：偏頭痛、叢集性頭痛和慢性反復發作性頭痛發作期三叉神經血管性頭痛激活，三叉神經節內逆向釋放以降鈣素基因相關肽(CGRP)、血管活性腸肽(VIP)、P物質(SP)、垂體腺苷酸環化酶激活的多肽(PACAP)和鎮痛素(nociceptin)等多種血管活性肽類物質明顯升高，疼痛緩解后其釋放水平降至基線，血管性頭痛時頸動脈血中CGRP升高，而SP和PACAP不高[1214]。因此，CGRP最具代表性，無論通過藥物、針刺、經顱磁刺激等方法只要降低CGRP的釋放水平就可以緩解頭痛。上世紀七八十年代推出特效抗頭痛劑Triptan類藥物重要作用環節就是選擇性激動腦底部血管壁5HT1B受體使血管收縮對抗CGRP的擴血管作用，激活三叉神經節內5HT1B/1D 受體抑制CGRP逆向釋放，使CGRP水平降至正常而緩解頭痛[23]。最新型的抗頭痛藥物CGRP受體拮抗劑BIBN4096BS在歐洲正進行Ⅲ期臨床試驗，已顯示出良好效果[1516]，美國LIPTON和SHEFTELL在最新一期《Headache》上報道未來十年CGRP拮抗劑可使偏頭痛急性期治療更徹底、更持久和更安全[5]。所以，目前血管性頭痛發生機制的研究重點和藥物作用新靶點開發都集中在三叉神經內CGRP合成、釋放、表達調控等環節。

頭痛是一種主觀感覺，無法取材，引發頭痛的內外刺激源和影響因素復雜多變，很難直接進行人體實驗等，都限制著血管性頭痛發生機制的深入研究。國內外學者建立的經典血管性頭痛模型就是基于以上學說應用物理、化學或生物等因素作用于動物，造成動物局部組織、器官或全身性損害，出現與人類頭痛發作時類似的功能、代謝或形態結構等方面病變。常用動物模型有硬腦膜、三叉神經節、上矢狀竇的電或化學刺激引發的神經性炎癥型模型；KCl或機械針刺誘導的大鼠皮層擴散型抑制模型；皮下注射硝酸甘油所致的血管性偏頭痛模型；利血平致5HT耗竭伴局部腦血管痙攣的小鼠偏頭痛模型；家族性偏癱型偏頭痛(familial hemiplegic migraine， FHM)基因相關性模型等[5，710]。但是，以上傳統的動物模型都不能精確模擬出血管性頭痛發作期CGRP的變化規律，也不能在體外精確控制各種因素后深入研究發病機制，而且三叉神經節內包含支配咀嚼肌的運動纖維、電或化學刺激三叉神經節后沖動上傳缺乏特異性、CGRP陽性纖維定量困難、刺激硬腦膜引發的神經源性炎癥是逆行性的，分離上矢狀竇后影響靜脈回流、腦脊液外漏、血液進入蛛網膜下腔激惹感覺神經末梢等缺點。建立一個理想的體外模型精確模擬出血管性頭痛急性發作期CGRP的釋放變化規律是目前深入研究其發病機制和開發新藥物的關鍵。我們的既往研究將大鼠腸系膜上動脈離體培養一定時間后，血管平滑肌細胞膜G蛋白偶聯受體調變規律非常類似于高血壓、糖尿病、脂質代謝紊亂等病理狀態下血管粥樣硬化改變，從而成為血管粥樣硬化發生機制研究的理想模型[1718]，啟發我們考慮三叉神經節體外培養模型是否也能用于血管性頭痛發生機制的研究。本研究將SD大鼠三叉神經節離體后置于無血清改良的DMEM培養液中培養12～48h后，發現CGRP、PACAP、nociceptin等血管活性肽類mRNA表達水平明顯增高，與血管性頭痛發作期CGRP釋放增高的核心表現完全吻合，其原因可能是當三叉神經節置于體外營養物質缺乏、缺血缺氧、神經節內分泌的炎性因子、神經生長因子等誘發局部神經源性炎癥反應而激活血管活性肽類物質表達，正好模擬出血管性頭痛發作期體內CGRP變化過程。離體的三叉神經節保留了神經元細胞體、神經纖維和部分神經鞘膜、髓鞘等主要結構組織[12]。三叉神經節離體培養是器官水平的研究模型，即克服了單純細胞培養條件單一，培養結果和細胞反應與生物體內實際情況相差較遠的局限性，又能在保留活體細胞和細胞外基質的前提下精確控制各種因素后深入研究血管性頭痛發生機制和預防策略，如在體外培養液中加入精確濃度的炎癥因子、Triptan類藥物、CGRP拮抗劑、細胞內信號轉導通路關鍵性蛋白激酶抑制劑等干預下，觀察三叉神經內CGRP表達的變化，從而在分子和細胞內信號轉導水平上揭示CGRP合成、釋放、表達調控等細胞內機制，為開發特效防治血管性頭痛藥物作用新靶點提供實驗數據。三叉神經節離體在無血清中培養模擬“Stress”環境因素，并能引起無菌性炎癥進一步激活MAPK通路，引起CGRP升高。本實驗室初步研究已經證實ERK1/2信號轉導通路特異性阻滯劑U0126能顯著降低三叉神經細胞內CGRP合成水平，說明ERK1/2信號通路可能參與了CGRP表達調控，這或許是未來藥物研制的一個方向。利用此模型，我們也已初步闡明三叉神經節內CGRP表達增高是在基因轉錄水平和蛋白質翻譯水平上神經性炎癥反應的結果。所以，三叉神經節離體培養是研究血管性頭痛發生機制和開發藥物作用新靶點的良好模型，利用此模型可進一步研究炎性因子IL1、IL6、TNFα和中藥提取物天麻皂甙、全蝎多糖對CGRP表達水平的影響。