【摘要】 目的 比較細胞膜色譜法中細胞膜固定相的特異性。方法 分別構建大鼠主動脈組織勻漿細胞膜固定相和培養大鼠主動脈平滑肌細胞膜固定相。用細胞膜色譜法研究10種αAR激動劑和拮抗劑的生物親和作用，測定其容量因子并進行相關性分析。結果 10種藥物在大鼠主動脈組織和培養大鼠主動脈平滑肌細胞膜固定相上容量因子之間存在正相關關系，相關系數r=0.923，有極顯著性意義(P<0.01)。結論 用培養的細胞制備細胞膜固定相具有更高的特異性，可提高藥物的保留時間，也可用于藥物的高效初篩。

【關鍵詞】 細胞膜 色譜 α腎上腺素受體

ABSTRACT: Objective To compare the specificities of the cell membrane stationary phases (CMSP) with cell membrane chromatography (CMC). Methods Cell chromatographic columns were constructed for both rat aorta tissue cells and cultured rat aorta smooth muscle cells. Then the chromatographic affinities of ten ligands of αadrenergic receptor (αAR) with both said chromatographic columns were investigated. Capacity factors (k＇)， as a chromatographic parameter， were calculated. Results The correlation analysis showed a positive correlation between the rat aorta tissue CMSP and the cultured rat aorta smooth muscle cell CMSP， with correlation factor of r=0.923， P<0.01. Conclusion By improving the specificity with the CMSP of cultured rat aorta smooth muscle cell， the enhanced CMC method is capable of affinities for evaluating ligandreceptors or drug screening.

KEY WORDS: cell membrane; chromatography; αadrenergic receptor

細胞膜色譜法 (cell membrane chromatography， CMC)是研究受體與藥物相互作用的新型親和色譜技術，將高效液相色譜、細胞生物學與受體藥理學相結合，利用藥物與膜受體間存在的特異性親和力，成功地將藥物體內的作用過程在色譜柱內進行動態模擬[14]。CMC法與放射性配體結合法和受體功能分析方法的相關性研究證明，三種方法得到的配體及其異構體對M、α、β受體親和力順序基本相同，并具有明顯的相關性[57]。為了研究組織器官和培養細胞制備的細胞膜固定相(cell membrane stationary phrase， CMSP)的異同，本次實驗將CMC法與細胞生物學方法相結合，用大鼠主動脈組織和其培養細胞CMC法研究了10種不同αAR激動劑與拮抗劑的生物親和作用。比較了傳統的CMC法(CMSP為組織細胞膜)與改進后的CMC法(CMSP為培養細胞)的特異性和相關性。建立了大鼠主動脈平滑肌培養細胞的CMC模型。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 羥甲唑啉(Oxymetazoline 296.84)、5甲基烏拉地爾(5methylurapidil， 5MU 401.5)購自RBI公司；RS17053(449)購自Roche Bioscience；去甲腎上腺素(Norepinephrine 319.3)、哌唑嗪(Prazosin 419.9)、酚妥拉明(Phentolamine 317.8)、苯腎上腺素(Phenylephrine 203.7)、甲氧明(Methoxamine 247.7)、育亨賓(Youhimbin 390.9)、BMY7378(458.4)購自Sigma公司。DMEM干粉培養基(GIBCO公司)、小牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、NaCl、鹽酸(HCL)、磷酸(H3PO4)、乙醇(C2H5OH)等均為國產分析純。

1.2 實驗動物 SD大鼠3只，體重100-150g，雌雄不拘，年齡2-3個月。由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。

1.3 儀器 Gilson高效液相色譜系統，包括370泵、115型紫外檢測器、7725型手動進樣閥(美國Rheodyne公司)和Anastar色譜工作站(奧泰科技有限公司)；HERMLE ZK410型低溫冷凍高速離心機(德國)；AS5150A超聲振蕩儀(Auto Science公司)；PHS2D型酸度計(上海第二分析儀器廠)；Shimadzu TB85型循環水浴(瑞士)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠主動脈組織細胞膜制備 取兩只SD大鼠，頸椎脫臼處死，迅速開胸，取出主動脈，置于冷的生理鹽水中，清洗數次，洗凈余血，用鋒利眼科剪除去主動脈壁周圍的脂肪及結締組織。將主動脈在勻漿管中剪碎，加入10倍量冷生理鹽水，制備勻漿。制得的勻漿在400×g離心10min，棄去沉淀，上清液10000×g離心10min。沉淀再以生理鹽水反復洗滌離心，直至沉淀為均勻的乳白色，然后加入一定量的低滲液，超聲振蕩20min，12000×g離心10min，棄去上清液，沉淀即為所需主動脈細胞膜。上述操作均在0-4℃下進行。

1.4.2 大鼠主動脈組織色譜柱的制備 取經活化處理的硅膠0.3g，作為細胞膜的載體置于低溫反應管中，在抽真空和震蕩條件下，分別加入上述細胞膜懸液，反應1h后，加入適量生理鹽水稀釋，在25℃條件下，使細胞膜磷脂雙層自融合，直至在硅膠載體表面形成均勻的細胞膜。低速離心除去上清液，載體細胞膜用TrisHCL緩沖溶液洗滌，除去未結合的細胞膜。

1.4.3 培養的大鼠主動脈平滑肌細胞膜的制備 大鼠主動脈平滑肌細胞原代培養[89]采用組織貼塊法。取SD大鼠，頸椎脫臼處死，在無菌環境中迅速剪取胸主動脈，移入盛有無菌培養液的平皿中。用眼科剪子將動脈縱行剖開，內膜面向上，用眼科小彎鑷輕輕刮去內皮細胞，用鐘表鑷細心撕下中膜的內中層，使其成1mm×1mm左右的血管片，用滴管移入事先鋪好血清的培養瓶內，均勻種植。放入37℃ CO2培養箱中4-6h后將培養瓶翻轉，加入4mL含20%(體積分數)小牛血清的DMEM培養液，使組織塊浸入培養液中，靜止5d。10d后可見細胞從植塊邊緣萌出。待20d左右細胞融合成片長滿瓶底。用2.5g/L(0.25%)胰蛋白酶和0.2g/L(0.02%)EDTA混合消化液，按常規方法消化。終止消化后放入含少許小牛血清的離心管中離心(1000×g離心8min)。傾去上清液，添加適當培養液吹打后分瓶，5d左右細胞長滿瓶底，再次依法作傳代培養。實驗采用第3-5代血管平滑肌細胞。當細胞覆蓋瓶底50%時，可將細胞取出制膜。將消化好的細胞懸液在1000×g離心10min。棄去上清液，加入一定量的低滲液，超聲振蕩20min，400×g離心10min。棄去沉淀，上清液12000×g離心10min后，沉淀既為所需細胞膜。

1.4.4 大鼠主動脈平滑肌細胞色譜柱的制備 大鼠主動脈平滑肌細胞色譜柱用上述的培養細胞的細胞膜制備(方法同1.4.2)。

1.4.5 10種αAR配體在兩種CMSP上的親和力色譜條件：柱溫為37℃，流速為0.5mL/min。用pH＝7.4的50mmol/L磷酸鹽緩沖液作為流動相，平衡3-4h后，將藥物分別添加到流動相中進樣分析(紫外檢測波長為220-280nm)。

2 結果

2.1 10種αAR配體在CMSP上的親和力 用50mmol/L磷酸鹽緩沖液分別平衡大鼠主動脈組織及其培養平滑肌細胞膜色譜柱3-4h后，根據每種藥物的紫外檢測波長測定結果進樣分析。藥品均用三蒸水溶解，質量濃度均為1g/L，每種藥物分別進樣3次，取平均值后計算不同藥物在主動脈組織CMSP上的容量因子k＇(表1、表2)。

表1 藥物在大鼠主動脈組織CMSP上的色譜作用參數（略）

Table 1 Chromatographic parameters of the drugs on rat aorta tissue cells CMSP column

capacity factors were calculated from k＇=(tR- t0)/ t0， where tR is retention time of ligands， t0 is retention time of solvent. CV=s/×100%; CMSP: cell membreme stationary phase; BMY7378: (8[2[4(2methoxyphenyl) 1piperazinyl] ethyl] 8azaspirol[4.5]decane7，9dione); RS17053: (N[2(2cyclopropylmethoxyphenoxy)ethyl] 5chloroα， αdimethyl1Hindole3ethanamine hydrochloride)

表2 藥物在大鼠主動脈平滑肌細胞膜CMSP上的色譜作用參數（略）

Table 2 Chromatographic parameters of the drugs on cultured rat aorta smooth muscle cells CMSP column

Capacity factors were calculated from k＇=(tR- t0)/t0， where tR is retention time of ligands， t0 is retention time of solvent. CV=s/×100%; CMSP: cell membreme stationary phase; BMY7378: (8[2[4(2methoxyphenyl) 1piperazinyl] ethyl] 8azaspirol[4.5]decane7，9dione); RS17053: (N[2(2cyclopropylmethoxyphenoxy)ethyl] 5chloroα，αdimethyl1Hindole3ethanamine hydrochloride) 在實驗所用不同的αAR激動劑和拮抗劑中，酚妥拉明為非選擇性α受體拮抗劑；哌唑嗪為α1選擇性拮抗劑，對α2的作用很弱，親和力為α1的1/1000；5甲基烏拉地爾、RS17053為α1A受體選擇性拮抗劑；BMY7378為α1D受體選擇性拮抗劑；去甲腎上腺素為α受體激動劑；甲氧明為α1受體激動劑；苯腎上腺素為α1受體激動劑；育亨賓為α2受體拮抗劑。由表1、表2可見，藥物在大鼠主動脈組織細胞CMSP上的保留時間由長到短依次為：哌唑嗪、5MU、酚妥拉明、BMY7378、羥甲唑啉、RS17053、育亨賓、甲氧明、去甲腎上腺素、苯腎上腺素。容量因子分別為：5.673、4.183、2.841、2.696、2.544、2.260、1.943、1.331、1.068。用培養主動脈平滑肌細胞制備的CMSP得到的αAR激動劑和拮抗劑的親和力順序由大到小分別為：哌唑嗪、酚妥拉明、5MU、羥甲唑啉、BMY7378、育亨賓、甲氧明、苯腎上腺素、去甲腎上腺素、RS17053。容量因子分別為：20.037、9.865、8.758、7.390、5.793、4.304、1.187、0.876、0.669、0。

2.2 藥物在兩種CMSP模型上的容量因子(k)相關性的比較 相關分析表明：藥物在大鼠主動脈組織、培養大鼠主動脈平滑肌細胞CMSP上容量因子之間存在正相關關系，相關系數r為0.923，相關系數有極顯著性意義(P<0.01)。

3 討論 本次實驗研究了αAR激動劑和拮抗劑在大鼠主動脈組織細胞和其培養細胞制備的CMSP上的親和力。建立了大鼠主動脈平滑肌細胞CMC模型。除了藥物RS17053在主動脈組織上的親和力強于培養的主動脈平滑肌細胞以外，其余藥物在這兩種CMSP上的總體趨勢是一致的。 培養的主動脈平滑肌細胞是主動脈血管的中膜部分，不僅純化了細胞，而且不含有內皮細胞。可能是RS17053與主動脈內皮細胞上多種受體的親和力較強。說明用組織器官和培養細胞制備CMSP的方法結果是一致的，只是用培養的主動脈平滑肌細胞制備細胞膜固定相后可以提高固定相上受體的純度和密度，延長藥物在色譜柱上的保留時間。 已有的研究表明大鼠主動脈的主要功能α1AR屬于α1D亞型，而大鼠腎動脈的主要功能α1AR屬于α1A亞型[1012]。韓啟德教授的課題組采用RNA酶保護分析與定量液相雜交方法顯示在大鼠主動脈α1AR mRNA的水平盡管以α1D亞型最高(占57%)，但α1A與α1B亞型同樣有mRNA的表達[13]。這個結論與我們用CMC法得出的實驗結果相符：α1DAR、α1AAR高選擇性藥物在大鼠主動脈組織色譜柱上均有保留，但親和力大小不同。 最初認為α2AR僅存在于阻力血管平滑肌而不存在于大血管，是根據在完整器官灌流條件下能顯示突觸后α2AR增加灌流壓的效應，而在離體血管標本則測不到α2AR介導的縮血管效應。隨著放射配體結合分析技術的產生與應用，現在證實除阻力血管外，不少大血管平滑肌中確實存在功能性α2AR。本次實驗選用α2AR高選擇藥物育亨賓，通過CMC法也證明了在主動脈血管上存在α2AR。