【摘要】 目的：為小兒水楊酸苯酚搽劑成品制劑的臨床安全使用提供實驗依據。方法：觀察大鼠完整皮膚及破損皮膚一次性涂抹最大耐受量（MTD）的小兒水楊酸苯酚搽劑所產生的毒性反應情況，從給藥0時起至7 d連續觀察記錄動物的急性毒性和45 d連續的長期毒性反應，以皮膚刺激反應標準進行評分作毒理等級評價；對存活動物在觀察結束時進行高位脫椎處死采血檢測外周血常規和血清生化，解剖后裸眼和病理切片觀察心、腦、肝、腎等主要臟器的病理變化。實驗數據以Bliss法處理計算LD50。結果：未測出LD50值；皮膚完好與破損組動物均產生輕度刺激反應；外周血常規和血清生化均未見明顯改變；心、腦、肝、腎等重要臟器裸眼和病理切片均未見明顯病理改變。結論：小兒水楊酸苯酚搽劑在小于MTD 2 000 mg/(kg·d) ［40 mL/(kg·d)］劑量下一次性涂大鼠皮膚后（該劑量相當于臨床劑量的800倍）以及1 000、500、200 mg/(kg·d)劑量的長期毒性試驗，均未產生明顯毒副反應。

【關鍵詞】 毒理學 急性毒性 長期毒性 水楊酸苯酚搽劑 最大耐受量 ［Abstract］ Objective:To provide scientific foundation for safely using Salicylic AcidPhenol Liniment. Methods: Integrated and disrepaired skins in the rats were smeared with Salicylic AcidPhenol Liniment by the maximum tolerated dose (MTD) only. The toxic reaction of the animals were observed and recorded continuously from the beginning of using the drug to 7 days， and evaluated by using the general standard of the reaction of skin stimulation in pharmacology. Animals were executed by taking off acanthi and blood was collected to check up the periphery blood routine and serum biochemistry at the end of the observation of the rats. And after the dissection， the pathological change of main visceras， such as heart， brain， liver and kidney were observed with naked eye and pathological slices. The data of this experiment was used to calculate the value of LD50 by using Bliss rule. Results: The value of LD50 was unavailable to be calculated. Lowgrade stimulation was observed in both integrated and disrepaired groups. There was no obvious changes in the periphery blood routine， serum biochemistry and pathological slices in the main visceras (heart， brain， liver and kidney). Conclusions: There are no obvious toxic reactions occurred to the rats by the doses 1 000， 500， 200 mg·kg-1·d-1 and smearing Salicylic AcidPhenol Liniment one time， whose dose was lower than MTD 2 000 mg·kg-1·d-1 (40 mL·kg-1·d-1).

［Key words］ Toxicology; Acute toxity; Longterm toxity; Salicylic AcidPhenol Liniment; Maximum tolerated dose 小兒水楊酸苯酚搽劑是我院臨床根據小兒生理、尤其是嬰幼兒病理生理特點，以《中國醫院制劑規范》中“水楊酸苯酚搽劑”處方［1］為基礎進行改良以適合兒童的皮膚用藥要求而配制的外用制劑，對兒童體表癬具有獨特的臨床療效，為臨床安全有效的使用該制劑，對其進行了急性毒性試驗，現將結果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 全自動血球計數儀TILH2000（法國），冰凍切片機620Eshandon（英國），OLYMPUS GX51倒置金相顯微鏡（日本）；DADE BEHRING DIMENSION RL全自動生化分析儀（美國），所用生化試劑均購自美國DADE BEHRING公司。

1.2 試驗材料

1.2.1 試藥 小兒水楊酸苯酚搽劑（處方為：水楊酸50 g、苯酚10 g、花生油加至1 000 g。批號060206、060302、060307，本院制劑室提供）；硫化鈉（天津大茂化學試劑廠，批號20070602）；羧甲基纖維素（湖南藥用試劑廠，批號2007021）。

1.2.2 動物 SPF級SD、Wistar大鼠，體重（200±20）g，重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（渝）20020001，環境設施合格證醫動字第310103002號。

2 方法與結果

2.1 皮膚局部刺激強度的評價標準 參照文獻［2］28對皮膚局部刺激反應的評分標準，擬定本試驗紅斑和水腫均按4分制，最高與最低分分別是4和0分。紅斑評分標準：無紅斑0分，勉強可見紅斑1分，明顯紅斑2分，中度到嚴重紅斑3分，紫紅色紅斑并有焦痂形成4分。水腫評分標準：無水腫0分，勉強可見水腫1分，皮膚隆起輪廓可見水腫2分，皮膚隆起近1 mm 水腫 3分，水腫隆起1 mm并范圍擴大4分。對皮膚刺激強度評價分為無刺激和輕、中、重度刺激4級，對應分值分別為0～0.49、0.5～2.99、3.0～5.99和6.0～8.0分。

2.2 完整和破損動物皮膚的急性毒性試驗

2.2.1 完整皮膚最大耐受量的預試

2.2.2 LD50及MTD的測定 取SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，試驗前24 h用10%硫化鈉溶液脫毛劑涂抹試驗大鼠背部約為體表面積的10%，脫去毛發后立即用（37±3）℃的清水沖洗凈殘留脫毛劑，正常飼養至試驗前12 h禁食、自由飲水，按每組10只隨機分為6組，以2 560 mg/(kg·d)為最大試驗劑量，按1∶0.7的比例設計5個分組試驗劑量，分別為2 560、1 792、1 254、878、615 mg/(kg·d)，按每只大鼠每次最大給藥容積2 mL/只的實驗設計，制備25%小兒水楊酸苯酚搽劑濃縮儲備溶液，根據試驗設計要求各取設計量的儲備溶液用羧甲基纖維素混懸液配制成2 mL，分別一次涂抹大鼠無毛處皮膚，然后用紗布和油紙包扎，固定24 h后去除，同時進行陰性（羧甲基纖維素組）對照試驗。從試驗開始后連續觀察10 d，主要觀察其皮膚毛發的變化、呼吸情況、自主活動、行為改變、皮膚刺激反應、眼睛、粘膜、體重變化、中樞神經系統及其他中毒表現等指標的變化情況，按“2.1”皮膚刺激反應評分標準記分進行評價。結果除在最高劑量組有1只死亡外，其余各組均未發現有死亡和特別異常的試驗大鼠，將試驗動物死亡率折算為死亡單位。

表1 SD大鼠皮膚一次性涂抹小兒水楊酸苯酚搽劑后的毒性反應（略）

2.2.2 皮膚刺激試驗 取SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只。（1）完好皮膚對照組：供羧甲基纖維素行完整皮膚陰性對照試驗；（2）破損皮膚對照組：用大頭針均勻劃破皮膚為＃字形，以滲血為準，造成損傷性皮膚，供羧甲基纖維素行皮損空白試驗；（3）破損皮膚試驗組：用大頭針均勻劃破皮膚為＃字形，以滲血為準，造成損傷性皮膚，供小兒水楊酸苯酚搽劑行皮損試驗；（4）完好皮膚試驗組：保持完整皮膚供小兒水楊酸苯酚搽劑試驗。按“2.2.2”的方法分別給試驗組大鼠以40 mL/(kg·d) ［2 000 mg/(kg·d)］劑量一次性涂抹小兒水楊酸苯酚搽劑，然后用紗布和油紙包扎（24 h后用溫水洗凈受試藥物的給藥部位），在給藥后0、1、3、6、12、24、48、72 h至第7 d，每日觀察并記錄試驗動物的生理活動，結果各組試驗大鼠的體重、皮膚、毛發、眼粘膜的變化、呼吸、中樞神經系統、四肢活動等表現正常，試驗組與對照組之間體重變化差異無統計學意義（χ2=9.86，P=0.6127），均無動物死亡，并按“2.1”皮膚刺激反應評分標準記分定量評價（見表2）。試驗結束時將各試驗組與陰性對照組大鼠頸椎高位脫位處死并立即解剖，裸眼仔細觀察心、腦、肝、腎、肺、脾等重要器官的改變。

2.2.3 外周血常規 （1）檢測指標：紅細胞、血紅蛋白、平均紅細胞體積、血小板計數、白細胞、平均血紅蛋白量、紅細胞壓積、平均血紅蛋白濃度、紅細胞分布寬度、血小板平均體積、淋巴細胞絕對值、中性粒細胞絕對值、中間粒細胞絕對值、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比等。（2）檢測方法：儀器法。結果見表3。

表2 SD大鼠皮膚一次性涂抹小兒水楊酸苯酚搽劑的皮膚刺激試驗（略）

表3 小兒水楊酸苯酚搽劑一次性涂抹SD大鼠外周血常規結果（略）

2.2.4 血清生化 （1）檢測指標：總膽紅素、直接膽紅素、總蛋白（TP）、白蛋白（ALP）、球膽白、谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）、谷草/谷丙比、堿性磷酸酶（AKP）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、谷氨酸氨基轉移酶（AST）、乳酸脫氫酶、血糖、甘油三酯（TG）、尿素氮（UREA）、肌酐（CREA）、尿酸等。（2）檢測方法：所有酶類生化指標均采用速率法，尿素采用尿酶法，肌酐采用苦味酸終點法，尿酸采用尿酸酶紫外法，總蛋白采用雙縮脲法，白蛋白、球蛋白采用溴甲酚綠法。結果見表4。

表4 小兒水楊酸苯酚搽劑一次性涂抹SD大鼠皮膚后的血清生化結果（略）

*GPT項與對照組比較P<0.05，其余各項與對照組比較P>0.05

2.3 病理組織切片及分析 所有急性毒性試驗大鼠在試驗觀察結束后頸椎高位脫位處死，仔細裸眼觀察有無明顯病理改變，隨即采集心、肝、腎、肺、脾等重要臟器置于福爾馬林溶液中固化24 h，切成組織小片，再經12 h固化，以不同濃度乙醇梯度脫水（8 h）后浸蠟2 h，干燥后置于冰凍切片機上切片，經二甲苯脫蠟，37 ℃干燥后經HE染色、封片，制作好病理切片后置于生物顯微鏡（ZEIS AXLOSKOP 400）下，在40～100倍視野下觀察病理改變。裸眼仔細觀察心、腦、肝、腎、肺、脾等重要器官未見明顯異常改變，100倍生物顯微鏡下病理切片見圖1～4。

2.4 長期毒性試驗［2］202［3、4］ 取體重為200 g的Wistar大鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只，常規飼養7d，經查血常規及肝、腎功能正常后供試驗。參考SD大鼠的MTD值并以其0.50、0.25、0.10倍設計3個劑量組：1 000、500、200 mg/(kg·d)和1個羧甲基纖維素對照組，按“2.2.2”的方法，分別給各試驗組Wistar大鼠用藥，對照組給予同體積的羧甲基纖維素，每天定時給藥一次，用油紙包扎脫毛處皮膚3 h，連續45 d。每天給藥后仔細觀察各動物的活動：外觀體征、行走情況、飲食、糞便、尿液等有無異常，每天按時測定體重一次，并根據大鼠體重變化調整給藥量。紀錄各項觀察指標，給藥結束時及停藥14 d各劑量組隨機取1/3的動物在DADE BEHRING DIMENSION RL全自動生化分析儀上進行血液學的紅細胞、白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等外周血象的常規檢測和肝、腎等重要器官的生化指標監測（包括TP、ALP、AST、ALT、GPT、GOT、AKP、血糖、TG、CREA、UREA等）。結果外周血象正常，生化除GPT高劑量組有明顯升高外（P<0.05），其余各組與對照組比較均無顯著變化（P>0.05），見表5。另將中途死亡或檢測結束的動物迅速剖取心、肝、脾、肺、腎、腦、子宮、睪丸等器官，肉眼觀察有無異常。并對各組的心、肝、肺、腎、脾等臟器進行病理組織切片檢查，結果高劑量組的各重要臟器均未見明顯的組織病變。

圖1 小兒水楊酸苯酚搽劑一次按MTD劑量涂抹大鼠破損皮膚后的心肌病理切片(4×10)（略）

圖3 小兒水楊酸苯酚搽劑一次按MTD劑量涂抹大鼠破損皮膚后的腎組織病理切片(10×10)（略）

圖2 小兒水楊酸苯酚搽劑一次按MTD劑量涂抹大鼠破損皮膚后的肺組織病理切片(10×10)（略）

圖4 小兒水楊酸苯酚搽劑一次按MTD劑量涂抹大鼠破損皮膚后的肝組織病理切片(4×10)（略）

表5 Wistar大鼠皮膚涂抹小兒水楊酸苯酚搽劑45 d的生化指標檢測結果（略）

*GPT項與對照組比較P<0.05，其余各項與對照組比較P>0.05

3 討論 小兒水楊酸苯酚搽劑由水楊酸、苯酚、花生油等多種成分配制而成的復方外用搽劑，具有良好的殺菌、抑制霉菌、溶解角質膿痂的作用，常用于黃癬、膿痂疹、毛囊角化癥及魚鱗癬等多種皮膚病。其處方中主藥成分為水楊酸，濃度為5％（g/g），為便于本試驗設計試驗劑量均以水楊酸的量作計算和設計。由于動物體表面積不便直接測定，按文獻對體表面積與體重進行近似換算體表面積［2］：A=R·W2/3，其中，A為動物體表面（m2），W為體重（kg），R是動物的體型系數，

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