作者：王明富 歐芹 朱貴明 王昭 冷莉莉

【摘要】 目的 探討山茱萸制劑對自然衰老小鼠腦組織的磷酸化酪氨酸信號適配蛋白（66kilodalton isoform of shcgene products，p66shc）表達的影響。方法 人工飼養(yǎng)自然衰老小鼠11～12月齡36只、青年鼠8只，分6組：青年對照組、衰老對照組和給藥組，給藥組又分為山茱萸納米水提液和醇提液的大劑量、小劑量組；各組給藥30 d，然后斷頭取小鼠肝組織做超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測，RTPCR法測定小鼠腦組織p66shc的表達。結果 山茱萸納米水提和醇提液給藥組SOD活性與衰老對照組相比顯著升高（P<0.01），而MDA含量和腦p66shc的表達顯著降低（P<0.01）；山茱萸納米制劑水提液小劑量、大劑量組和醇提液比較上述作用均更顯著（P<0.01） 。結論 山茱萸能夠明顯降低衰老小鼠腦p66shc活性亞基的表達，從而影響p66shc活性起到延緩衰老的作用。山茱萸納米水提取液小劑量組的作用優(yōu)于山茱萸納米醇提液各組。

【關鍵詞】 山茱萸；p66shc活性；衰老小鼠；腦組織；納米水提取液

磷酸化酪氨酸信號適配蛋白（66kilodalton isoform of shcgene products，p66shc)是近幾年研究較多的基因，敲除某些動物p66shc基因可以延長生物個體的壽命〔1〕。該基因的研究將機體衰老與細胞信號轉導聯(lián)系起來〔2〕，成為衰老機制研究的新熱點。在分子水平上，正常衰老過程中壓力感受基因的表達也有所提高，說明氧化應激反應參與并促進衰老〔2〕。本研究觀察自然衰老模型小鼠腦組織p66shc活性的變化及山茱萸納米水提液對其的影響，研究腦組織p66shc表達是否與機體衰老過程直接相關，及山茱萸納米水提液抗衰老作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

11～12月齡自然衰老小鼠36只，體重41～50 g，由佳木斯大學實驗動物中心提供。衰老小鼠按體重隨機分成5組，即納米水提大劑量組8只、小劑量組7只；納米醇提大劑量組6只、小劑量組7只；自然衰老組(自然對照組)8只；另外，青年小鼠3月齡8只（青年對照組），共計6組。動物自由飲食，室溫（24±2）℃飼養(yǎng)，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、RTPCR試劑盒由大連寶生物公司提供，中藥山茱萸在佳木斯醫(yī)學藥店購買。山茱萸常規(guī)粉碎機粉碎，球磨機研磨48 h制成納米顆粒，分別用水和75%乙醇溶液浸泡36 h，過濾取上清液，旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)掉多余水分和乙醇，取終產(chǎn)物凍干保存。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)

納米水提大劑量組、納米水提小劑量組、納米醇提大劑量組、納米醇提小劑量組分別按照小劑量0.75 g·kg-1·d-1；大劑量1.50 g·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)給藥30 d后斷頭取小鼠腦組織以RTPCR法測定p66shc活性的表達，小鼠肝組織做SOD、MDA檢測。

1.2.2 指標的測定

RTPCR法測定小鼠腦組織p66shc表達：Trizol法提取總RNA，用DU800檢測OD值，選取OD值1.8～2.2范圍內(nèi)的總RNA作為模板進行反轉錄，取反轉錄產(chǎn)物94℃變性30 s，59.5℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)進行PCR反應，產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析；肝組織采用電動玻璃勻漿器勻漿，離心去上清液進行SOD、MDA檢測，采用分光光度法測定OD值。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SAS法進行F檢驗，多重比較采用q檢驗。

2 結 果

2.1 不同劑量山茱萸組衰老小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的變化 衰老對照組小鼠與其他各組相比SOD活性顯著降低、MDA顯著增加（P<0.01），納米水提小劑量、大劑量組與納米醇提大、小劑量組相比SOD活性顯著增加（均P<0.01）；而MDA顯著降低（均P<0.01）；但未達到青年對照組水平。見表1。表1 不同劑量山茱萸組衰老小鼠肝組織SOD、MDA含量的變化(略)

2.2 不同劑量山茱萸組腦組織P66shc的表達水平比較

衰老對照組小鼠腦組織p66shc的表達水平(1.532±0.09)較青年對照組(0.691±0.136)、納米水提大劑量組(0.798±0.089)、納米水提小劑量組(0.830±0.081)相比顯著增高（P<0.01）；而納米水提小劑量、大劑量組與納米醇提大(1.157±0.263)、小劑量組(1.087±0.175)相比表達則顯著降低（P<0.01）。

3 討 論

大量的實驗研究證明衰老的機體氧自由基含量明顯升高。表面上看，氧應激和遺傳在決定衰老的問題上是兩個獨立的事件，但越來越多的實驗證據(jù)說明二者存在著本質的聯(lián)系〔3〕。在分子水平上，正常衰老過程中壓力感受基因表達有所升高，表明氧化應激參與并促進衰老，基因功能分析表明哺乳動物原癌基因shcA編碼的p66shc蛋白可能是聯(lián)系凋亡和衰老的交匯點〔2〕。p66shc作為一個細胞內(nèi)活性氧( reactive oxygen species，ROS)濃度高低的感受器，進而促進細胞凋亡，調節(jié)細胞壽命。p66shc已被研究證明在細胞的氧化應激應答中起重要作用，它通過叉頭轉錄因子家族調節(jié)胞內(nèi)氧化還原平衡及凋亡。p66shc在氧化應激狀況下調節(jié)磷酸化FoxO轉錄因子的活性，而磷酸化FoxO是PBKAKTFoxO信號轉導途徑中的環(huán)節(jié)。p66shc上的絲氨酸磷酸化位點的磷酸化狀態(tài)直接影響著其信號適配功能，從而參與細胞的凋亡調控〔4〕。p66shc即是哺乳動物與生命周期密切相關的蛋白質，也是近年來研究細胞氧化應激反應的主要蛋白，它通過在線粒體內(nèi)氧化細胞色素C產(chǎn)生大量活性氧導致細胞氧化損傷〔5〕。研究結果說明，山茱萸納米制劑能夠明顯提高衰老小鼠肝細胞SOD活性、降低MDA含量，達到清除體內(nèi)的氧自由基和保護細胞免受應激反應損害的作用。同時p66shc在衰老小鼠腦組織表達增加，而山茱萸可通過下調衰老小鼠腦細胞p66shc的表達，表現(xiàn)出對氧化應激的抗性〔1〕。但有的學者研究結果證明p66shc在百歲老人成纖維細胞中居然是高表達〔6〕，表明了p66shc基因與長壽的相關性及這種關系的復雜性〔7〕。但是，p66shc基因表達產(chǎn)物在氧化應激及在衰老與抗衰老過程中的重要作用值得進一步探索研究。山茱萸納米制劑作用的研究結果表明，山茱萸納米水提液不僅可以發(fā)揮良好的延緩衰老作用，而且可以降低藥物的用藥劑量，這對山茱萸制劑的進一步開發(fā)提供了重要的依據(jù)。