作者：王紅梅，肖玉潔，韓正祥，高向陽3，裴冬生，杜秀平

【摘要】 目的 制備基因載體殼聚糖納米粒，研究其結構特征及其體外對細胞的轉染活性。方法 以復凝聚法制備殼聚糖-pDNA納米粒;電鏡測定其形態(tài)、粒徑;凝膠電泳阻滯實驗觀察殼聚糖和pDNA的結合力;紫外可見分光光度計測定其負載力、負載率;體外轉染入人胚腎細胞293T，熒光顯微鏡觀察轉染效率，CCK8法評價細胞毒性。結果 殼聚糖-pGFP 納米粒多呈球形，直徑為(132±48)nm;凝膠電泳阻滯實驗示pGFP被完全包裹在納米粒內(nèi);其負載力(LC)為(48.2±2.0)%，負載率(LE)為100%;體外轉染實驗證明殼聚糖-pGFP納米粒能介導pGFP轉染293T細胞并在細胞中表達綠色熒光蛋白;殼聚糖-pDNA抑制率(26.08±4.28)%。結論 采用復凝聚法制備的殼聚糖-pDNA納米粒可有效轉染至細胞內(nèi)，但有一定的細胞毒性。

【關鍵詞】 殼聚糖;納米粒;基因載體;轉染

Abstract:Objective To prepare chitosan nanoparticles as gene vectors so as to investigate their structural characteristics and cell-gene transfection efficiency in vitro.Methods The chitosan-pDNA nanoparticles were prepared by a complex coacervation method and their morphology as well as the particle diameter were observed under the electronic microscope. The binding of pDNA was evaluated by agarose gel electrophoresis analysis; the loading capacity and loading efficiency were determined with UV/Vis spectrophotometer. The transfection experiments were performed with human embryonic kidney 293T cell line in vitro. The transfection efficiency was measured under fluorescent microscope. The cytotoxicity was observed with Cell Counting Kit-8 (CCK-8).Results The chitosan-pDNA nanoparticles were mainly spherical， with an average diameter of (132±48)nm. The agarose gel electrophoresis analysis confirmed the DNA was wholly encapsulated in the nanoparticles. The loading capacity was (48.2±2.0)% and loading efficiency was 100%. Transfection in vitro proved that chitosan-pDNA was efficient in 293T cells and the expression of green fluorescent proteins was observed under fluorescent microscope. The inhibition percentage of nanoparticles was (26.08±4.28)%.Conclusions The chitosan-pDNA nanoparticles can be effectively transfected into cells. A certain degree of cytotoxicity was observed by CCK8， though.

Key words： chitosan; nanoparticles; gene vector; transfection

基因治療為近年研究熱點，高效低毒的載體為基因治療的關鍵[1]。殼聚糖作為一種聚陽離子基因載體，是由葡糖胺和N- 乙酰基葡糖胺構成的生物共聚物，有較好的生物相容性和生物可降解性，免疫原性低，毒性小;而且殼聚糖易于和帶負電荷的DNA形成納米級復合物，能有效保護DNA免受核酸酶的降解[2]。目前被認為是很有潛力的基因遞送載體[3]。本研究以殼聚糖作為載體，制備殼聚糖-pDNA納米粒，觀察其結構特征，并在細胞水平上測定其轉染效果。

1 材料和方法

1.1 材料 殼聚糖(分子式：C12 H24 N2O9，分子質量：340)購自Sigma-Aldrich公司，脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen 公司，293T人胚胎腎細胞購自中科院上海細胞庫，表達綠色熒光蛋白的質粒PGPU6/GFP/Neo-shNC購自上海吉瑪公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁化學研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 293T人胚胎腎細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清、1×108 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640+HEPES培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3～5天按1∶3～1∶5的比例進行傳代。

1.2.2 殼聚糖-質粒(pDNA)微粒體的制備(復凝聚法) 取殼聚糖500 mg，溶解于1%乙酸溶液，濃度0.5%(pH 4.5)，超聲震蕩至澄清，121℃，高壓滅菌20 min備用。 pDNA溶解于滅菌20%Na2SO4溶液中，濃度為25 mg/L。取0.5%的殼聚糖與等體積的pDNA溶液混合，在漩渦混合器上充分混勻后，12000 r/min、4℃離心20 min， 沉淀物以PBS重懸，此為殼聚糖-pDNA微?；鞈乙?。

1.2.3 殼聚糖-pDNA納米粒的形態(tài)和粒徑測定 取少量殼聚糖-pDNA納米?；鞈乙海沃龄佊刑寄さ你~網(wǎng)上，靜置2 min，用濾紙吸干混懸液，再滴加1%(W/V)磷鎢酸復染2 min，于透射電子顯微鏡下觀察微粒形態(tài)并拍照。

1.2.4 殼聚糖-pDNA納米粒凝膠電泳阻滯實驗 分別取裸pDNA液、殼聚糖-pDNA混懸液、殼聚糖液及制備殼聚糖-pDNA混懸液離心后上清液20 μl，以1%瓊脂糖凝膠水平電泳實驗。

1.2.5 殼聚糖包封pDNA測定 將制備的殼聚糖-pDNA納米?；鞈乙罕M可能吸盡上清液，凍干、稱重，標記為W0。收集上清液，UV法在波長260 nm處測定上清液未結合pDNA濃度，標記為Ws。將制備微粒時pDNA加入量記為WpDNA。按下列公式計算負載力(loading capacity， LC)及負載率(loading efficiency， LE)：LC=(WpDNA-Ws)/W0×100%， LE=( WpDNA-Ws) /WpDNA×100%。

1.2.6 體外轉染實驗 將293T細胞接種于6孔板，每孔接種6×105個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)細胞約24 h(細胞融合60%～70%)，使細胞達對數(shù)生長期，進行轉染實驗。設立殼聚糖-pDNA孔、脂質體Lipofectamine 2000陽性對照孔、陰性對照孔、空白孔，每組設3個復孔。吸盡舊培養(yǎng)基，將殼聚糖-pDNA納米?；鞈乙?00 μl(質粒2.5 μg/孔)加入殼聚糖-pDNA孔中，同時制備500 μl脂質體-pDNA復合物加入陽性對照孔中，陰性對照孔中放入500 μl殼聚糖懸液，再每孔加入1.5 ml無血清培養(yǎng)基。十字搖勻法混勻，放回CO2培養(yǎng)箱孵育，4～6 h后換成有血清的培養(yǎng)基。24～72 h，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光。

1.2.7 CCK8實驗 取對數(shù)生長期293T細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞，細胞融合至60%～70%時進行轉染。設殼聚糖-pDNA孔、脂質體-pDNA孔、殼聚糖孔、空白孔。轉染方法同前，質粒為0.1 μg/孔，每組設5個復孔。培養(yǎng)48 h 后，每孔加CCK-8試劑10 μl，再培養(yǎng)4 h。在酶標儀進行雙波長測定， 波長450～490 nm，參比波長600～650 nm，測D值。實驗重復3次。細胞存活率=(D試驗組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100 %，細胞生長抑制率(IR)=(1-細胞存活率)×100 %。

1.3 統(tǒng)計學處理 定量資料用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。設檢驗水準：α=0.05。

2 結 果

2.1 殼聚糖-pDNA納米粒的形態(tài)和粒徑 透射電子顯微鏡觀察結果表明，殼聚糖-pDNA納米粒多呈球形(圖1)，按放大倍數(shù)計算，微粒直徑在100～200 nm之間，平均約(132±48)nm。

圖1 殼聚糖-pDNA納米粒電鏡照片(×20000)

2.2 殼聚糖-pDNA納米粒凝膠電泳阻滯實驗 凝膠電泳阻滯實驗結果如圖2。殼聚糖-pDNA納米粒能阻滯pDNA向陽極移動，使pDNA滯留于加樣孔中而發(fā)亮，表明pDNA與殼聚糖之間通過靜電作用有效凝聚。殼聚糖孔和離心后上清液孔均未見到發(fā)亮的pDNA。

圖2 殼聚糖-pDNA納米粒凝膠阻滯實驗

1.裸pDNA;2，3.殼聚糖-pDNA納米粒;4.殼聚糖;5.離心后上清液; 6、7. DNA Marker

2.3 殼聚糖包封pDNA測定 應用UV法測定上清液中未結合pDNA濃度，在260 nm處為負值，pDNA濃度為負值，經(jīng)計算殼聚糖LC為(48.2±2.0)%，LE為100%，表明殼聚糖完全包封pDNA。

2.4 體外轉染實驗 轉染24 h觀察，脂質體質粒轉染組有散在的綠色熒光點，殼聚糖質粒組無熒光點。48 h時觀察，脂質體組熒光明顯增多，亮度增加，殼聚糖質粒組散在綠色熒光，亮度弱，部分細胞脫壁死亡(圖3～ 6)。72 h觀察熒光均減少，殼聚糖質粒組死亡細胞增多，脂質體質粒組細胞狀態(tài)基本正常。

熒光顯微鏡觀察48 h時轉染率最高。殼聚糖-pDNA 納米粒組轉染率〔(4.25±2.26)%〕，脂質體轉染率〔(33.65±7.16)%〕(P<0.05)。

2.5 CCK8實驗 殼聚糖-pDNA抑制率(26.08±4.28)%、脂質體-pDNA抑制率(8.66±4.25)%、殼聚糖組抑制率(16.9±3.59)%，殼聚糖-pDNA組抑制率與脂質體-pDNA組相比有明顯差異(P<0.05)。殼聚糖也有抑制細胞生長作用。

3 討 論

殼聚糖是一種弱堿性的天然高分子多聚糖，在酸性條件下溶解，荷正電， 能通過靜電作用結合帶負電的pDNA 分子， 因為細胞表面帶負電荷，其復合物被細胞通過靜電作用攝取。根據(jù)殼聚糖的這些特點，本實驗以復凝聚法制備了殼聚糖-pDNA 納米粒，對其相關指標進行檢測，其直徑在100～200 nm，小于細胞膜的孔徑，利于細胞順利攝取。凝膠電泳阻滯實驗和負載力，負載率的測定證明pDNA完全被殼聚糖包裹。殼聚糖-pDNA納米粒的構建是成功可行的。

本實驗的體外基因轉染以轉染效率較高的293T為靶細胞，通過殼聚糖轉染pEGFP，結果顯示熒光顯微鏡下細胞內(nèi)可觀察到綠色熒光，說明納米粒能將綠色熒光蛋白基因遞送到細胞內(nèi)，成功轉染并表達綠色熒光蛋白。有研究表明殼聚糖在體內(nèi)和體外有較好的轉染效果[4-6]，Sato等[7]發(fā)現(xiàn)，當殼聚糖相對分子質量為15或52 kDa，質粒：殼聚糖為1∶5，pH為6.9，轉染培養(yǎng)基含血清時，殼聚糖-DNA微粒的轉染效率最好。有很多研究者對殼聚糖進行改性來提高其轉染效率[8-9]。本實驗結果顯示，殼聚糖和陽性對照脂質體比較，轉染率低。其原因考慮為殼聚糖-pDNA納米粒的轉染效率受到殼聚糖分子量、粒徑、N/P比值、pH值、脫乙酰度、DNA濃度等多種因素的影響。

在CCK8實驗中，殼聚糖組及殼聚糖-pDNA 納米粒組顯示出較強的細胞毒性，與脂質體組比較有明顯差異(P<0.05)。有學者認為，殼聚糖的細胞毒性與脫乙酰度、化學結構、黏度和相對分子質量有關，同一種殼聚糖對不同的腫瘤細胞有不同程度的抑制作用[10]。本實驗中，觀察到pH值為一個非常重要的影響因素。殼聚糖為弱堿性，不溶于中性和堿性溶液[11]。培養(yǎng)基中添加HEPES緩沖鹽，是以NaHCO3和稀HCl調定，pH值為7.0～7.2，其緩沖能力較強。殼聚糖-pDNA 納米粒混懸液偏酸，兩者混合后，殼聚糖納米粒在pH值變化后的液體中析出成實驗中所見云絮狀物，液體滲透壓也發(fā)生相應變化。細胞對pH值、滲透壓變化很敏感，因此鏡下觀察到脫壁死亡。正因如此，細胞狀態(tài)差也同時影響了基因的轉染率。

綜上所述，殼聚糖可有效包封DNA，保護DNA免受降解，可以成功地轉染至靶細胞內(nèi)，其轉染條件實驗的優(yōu)化及體外轉染效果有待進一步研究。