作者：盧秀霞 龍曉英 丁鋼 袁飛 陳金愛 陳秋偉 張海龍

【摘要】 目的 研究辣椒堿納米乳注射劑的處方和制備工藝，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 以外觀、粒徑、包封率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)篩選處方成分，包括油相、乳化劑、助乳化劑組成及比例，同時(shí)優(yōu)化制備工藝。結(jié)果 優(yōu)選得辣椒堿納米乳處方組成為：中鏈脂肪酸三甘油酯∶吐溫80∶豆磷脂∶丙二醇的質(zhì)量比為1.5∶2.5∶1.25∶1.5;所制得納米乳滴平均粒徑6.16 nm，多分散系數(shù)0.307，包封率85.22％。結(jié)論 制得的辣椒堿納米乳制備工藝簡(jiǎn)單，并符合納米乳主要指標(biāo)要求。

【關(guān)鍵詞】 辣椒堿 納米乳 粒徑 含量測(cè)定 包封率

辣椒堿（capsaicin）是辣椒辛辣物質(zhì)和具有藥物活性的主要成分［1］。純辣椒堿為白色針狀晶體，熔點(diǎn)65～66 ℃；易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑及堿性水溶液，但難溶于水。 辣椒堿通過選擇性拮抗神經(jīng)肽P物質(zhì)，減少炎性介質(zhì)組胺、緩釋肽和前列腺素生成、釋放而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛效果［2］，有效治療帶狀皰疹后遺癥神經(jīng)痛、糖尿病神經(jīng)痛、面部神經(jīng)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎等疼痛，是新型非成癮性鎮(zhèn)痛藥［3］。由于療效肯定，美國(guó)藥典24版已經(jīng)收載。目前，市場(chǎng)上辣椒堿產(chǎn)品主要是皮膚局部用制劑［46］，起效慢、藥物吸收不完全，且對(duì)皮膚刺激性大，病人順應(yīng)性較差。 納米乳（nanoemulsion）是粒徑為10～100 nm的乳滴分散在另一種液體中形成的膠體分散系統(tǒng)，屬熱力學(xué)穩(wěn)定體系［7］。作為一種新型給藥系統(tǒng)，納米乳不良反應(yīng)小、安全性高，對(duì)難溶性藥物有較強(qiáng)增溶能力，有效提高藥物的生物利用度而受到極大關(guān)注［8-11］。因此，本文將辣椒堿制成納米乳注射劑，以增加辣椒堿的溶解度，減少刺激性，同時(shí)通過控制粒徑（＜100 nm），避免網(wǎng)狀內(nèi)皮單核細(xì)胞吞噬系統(tǒng)（MPS）吞噬而延長(zhǎng)辣椒堿體內(nèi)作用時(shí)間，改善辣椒堿生物學(xué)性質(zhì)，最終達(dá)到起效快、鎮(zhèn)痛時(shí)間長(zhǎng)、副作用低的目的，為擴(kuò)大辣椒堿臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器 JB2型恒溫磁力攪拌器（上海智光儀器儀表有限公司），十萬(wàn)分之一電子分析天平（BP211D，德國(guó)賽多利斯），F(xiàn)4500 Hitachi 熒光分光光度計(jì)（日本日立公司），Zetasizer Nano ZS 90納米粒度及Zeta電位分析儀（英國(guó)Malvern Instruments Ltd），JELIOOCXⅡ透射電鏡(日本)，Shimadzu LC10A 高效液相色譜儀（日本島津公司），Shimadzu RF10AXL熒光檢測(cè)器（日本島津公司）。

1.2試藥 辣椒堿原料（貴州安順生達(dá)生物科技開發(fā)公司，純度≥97%，批號(hào)20030503），辣椒堿對(duì)照品（SIGMA 公司，純度≥97％，批號(hào)2069698），中鏈脂肪酸三甘油酯（MCT，德國(guó) Sasol Germany GmbH，iv 級(jí)，批號(hào)061224），吐溫80（上海申宇醫(yī)藥有限公司，藥用級(jí)，批號(hào)080201），豆磷脂（上海金伴藥業(yè)有限公司，藥用級(jí)，批號(hào)021109），葡聚糖SephadexG50（北京拜爾迪生物公司，批號(hào)17004302），丙二醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)071012），色譜甲醇（天津四友化學(xué)試劑廠），超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1納米乳處方篩選

2.1.1納米乳的制備稱取適量的藥物、油、乳化劑、助乳化劑，攪拌混勻，50 ℃水浴加熱溶解，得均勻透明的溶液；在磁力攪拌下將此溶液逐滴加入60～65 ℃蒸餾水中乳化。

2.1.2油、表面活性劑種類分別以大豆油、MCT、油酸乙酯為油相，吐溫80、泊洛沙姆F68、豆磷脂為乳化劑，考察外觀及700 nm透光率（此波長(zhǎng)藥物、輔料自身無(wú)吸收，透光率僅與乳滴大小成反比），初步篩選乳劑的組成，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：乳化劑與油的質(zhì)量比為4∶1時(shí)，乳化劑的乳化能力由強(qiáng)到弱排列是：吐溫80＞泊洛沙姆F68＞豆磷脂，故選擇吐溫80為乳化劑；油相被乳化由強(qiáng)到弱排列是：油酸乙酯≈MCT＞大豆油，而MCT已被歐洲藥典準(zhǔn)許用于注射劑，且已有上市產(chǎn)品［12］436-439，故選擇MCT為油相。 表1油相、表面活性劑種類對(duì)粒徑的影響（略）

Table 1Effect of oil phase and surfactants on particle size

2.1.3表面活性劑用量 吐溫80與MCT按不同質(zhì)量比，分別以4∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1∶1混合，按“2.1.1”項(xiàng)制備，考察外觀及700 nm透光率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：在MCT與丙二醇的量、制備工藝相同前提下，吐溫80∶MCT≥2.5∶1時(shí)能形成微乳。因此，選擇吐溫80∶MCT=2.5∶1作為表面活性劑與油最低比例。

2.1.4復(fù)合乳化劑比例固定（吐溫80+豆磷脂）∶MCT=2.5∶1，將吐溫80與豆磷脂按不同質(zhì)量比混合，考察方法同“2.1.3”項(xiàng)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：當(dāng)吐溫80∶豆磷脂≥2∶1時(shí)能形成微乳。為減少吐溫80的用量，選擇吐溫80∶豆磷脂=2∶1為復(fù)合乳化劑比例。

2.1.5油濃度固定吐溫80∶豆磷脂∶MCT=0. 25∶0.125∶0.15，按“2.1.1”項(xiàng)制備，考察MCT不同濃度時(shí)的包封率。由表4可見，辣椒堿納米乳包封率隨MCT濃度的增大而相應(yīng)提高，當(dāng)MCT濃度上升至1.50%，包封率為85.22%，符合藥典的相關(guān)規(guī)定（包封率＞80%）。

2.2納米乳制備工藝優(yōu)化

2.2.1乳化溫度選擇將藥物、油、復(fù)合乳化劑、助乳化劑按處方量混勻，50 ℃水浴加熱溶解，得均勻透明的溶液，在磁力攪拌下將此溶液分別逐滴加入60～65 ℃與常溫（25 ℃）蒸餾水中乳化30 min。辣椒堿納米乳包封率結(jié)果見表5。結(jié)果表明：60～65 ℃乳化的包封率略高于常溫乳化。為簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，選擇常溫（25 ℃）乳化。

表2油與表面活性劑比例對(duì)粒徑的影響（略）

Table 2Effect of the proportion between oil and surfactants on particle size

表3復(fù)合乳化劑比例對(duì)粒徑的影響（略）

Table 3Effect of the proportion of composite emulsifiers on particle size

表4油濃度對(duì)辣椒堿納米乳包封率的影響（略）

Table 4Effect of oil concentration on entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion

2.2.2油、水滴加順序?qū)⑺幬铩⒂汀?fù)合乳化劑、助乳化劑按“2.2.1”項(xiàng)制備均勻透明的溶液，在磁力攪拌下，分別將此溶液逐滴加入25 ℃蒸餾水中，以及將25 ℃蒸餾水一次傾入該溶液中乳化30 min，包封率結(jié)果見表6。結(jié)果表明：油、水滴加順序?qū)Π饴视绊懖淮蟆？紤]今后工業(yè)生產(chǎn)更簡(jiǎn)單，選擇蒸餾水一次傾入油中乳化的方式。

表5溫度對(duì)辣椒堿納米乳包封率影響（略）

Table 5Effect of temperature on entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion

表6制備工藝對(duì)辣椒堿納米乳包封率影響（略）

Table 6Effect of preparation technology on entrapmentefficiency of capsaicin nanoemulsion

2.3辣椒堿納米乳注射劑的制備 依據(jù)辣椒堿納米乳處方設(shè)計(jì)與工藝研究結(jié)果，結(jié)合注射劑的制備工藝，擬定辣椒堿納米乳注射劑制備工藝如下：按處方量稱取辣椒堿、油、乳化劑、助乳化劑，50 ℃水浴加熱溶解，得均勻透明的溶液；在磁力攪拌下，將常溫蒸餾水（0.22 μm濾過滅菌）傾入該溶液乳化30 min，形成淡黃色、澄清透明的辣椒堿納米乳。于潔凈環(huán)境下，0.22 μm微孔濾膜過濾辣椒堿納米乳，將續(xù)濾液灌裝在已滅菌的2 mL、5 mL安瓿中，拉封。將灌封好的辣椒堿納米乳注射劑121 ℃、0.1 MPa熱壓滅菌15 min，即得。

2.4形態(tài)與粒徑測(cè)定

2.4.1形態(tài)測(cè)定取適量辣椒堿納米乳，滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜止10 min后用濾紙片吸干，滴加1～3％磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染5 min，自然揮干，用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明:納米乳劑中的乳滴呈類球形，粒徑分布均勻。

圖1辣椒堿納米乳透射電鏡照片(×50 000)（略）

Figure 1Transmission electron photograph of capsaicin nanoemulsion(×50 000)

2.4.2粒徑大小與分布測(cè)定取辣椒堿納米乳適量，采用動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）原理的Nicomp380/ZLS激光粒度/動(dòng)電位分析儀測(cè)定，其粒徑與粒度分布見圖2。結(jié)果表明：辣椒堿納米乳的平均粒徑6.16 nm，多分散系數(shù)0.307，粒度分布均勻。

圖2辣椒堿納米乳粒徑分布圖（略）

Figure 2Particle size distribution of capsaicin nanoemulsion

2.5動(dòng)電位測(cè)定 采用電泳光散射（electrophoretic light scattering，ELS）法，取辣椒堿納米乳適量，室溫下置Nicomp380/ZLS激光粒度/動(dòng)電位分析儀測(cè)定，動(dòng)電位分布見圖3。結(jié)果表明，所得辣椒堿納米乳電位(ζ)平均值為－34.0 mV。

2.6pH值測(cè)定 測(cè)定3批辣椒堿納米乳的pH值，每批測(cè)定3次，取平均值。3批乳劑的pH值分別為5.45、5. 43、5.45，符合靜脈注射劑對(duì)pH值的要求。

圖3辣椒堿納米乳動(dòng)電位分布圖

Figure 2Zeta potential microscope distribution of capsaicin nanoemulsion

2.7辣椒堿納米乳含量測(cè)定

2.7.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇水磷酸（體積比70∶30∶0.1）；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)為λex=283 nm，λem=310 nm；流速為1. 0 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL。辣椒堿保留時(shí)間12.3 min，理論塔板數(shù)4 156，拖尾因子1.13，峰形對(duì)稱，色譜圖見圖4A。

2.7.2樣品溶液的制備精密稱取0.10 mg辣椒堿對(duì)照品，無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL，取該液1. 0 mL，無(wú)水乙醇稀釋至10 mL，搖勻，制得1.0 μg/mL辣椒堿對(duì)照液。精密量取0.004%辣椒堿納米乳0. 30 mL（約相當(dāng)于辣椒堿12 μg），無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL，超聲混勻，制得1.2 μg/mL辣椒堿供試液。精密量取不含辣椒堿的空白納米乳0.30 mL，同法制得陰性對(duì)照液。

2.7.3方法專屬性考察分別量取對(duì)照液、供試液及陰性對(duì)照液20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，空白基質(zhì)無(wú)干擾，且供試液與對(duì)照液保留時(shí)間基本一致，見圖4。

圖43種樣品溶液熒光HPLC圖（略）

Figure 4FluorescenceHPLC of three samples

2.7.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取辣椒堿對(duì)照品0. 20 mg于10 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得20 μg/mL辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取該儲(chǔ)備液0.1、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0 mL置10 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列濃度對(duì)照液。分別進(jìn)樣20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以對(duì)照液質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：A=4×106ρ-224614，r=0.999 7，結(jié)果表明辣椒堿在0.20～6.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以信噪比（S/N）＝3計(jì)算，測(cè)得辣椒堿最低檢測(cè)限為0.1 ng。

2.7.5精密度試驗(yàn)取 0.1 μg/mL辣椒堿對(duì)照液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得平均峰面積為10 012 711，RSD為0.54%，表明儀器精密度良好。

2.7.6重現(xiàn)性試驗(yàn)按上述方法制備濃度為0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 μg/mL的辣椒堿供試液，各3份，以1. 0 μg/mL辣椒堿對(duì)照液的峰面積定量，結(jié)果各濃度辣椒堿含量平均值為91.10%、94.94%、91. 03%、91.01%、90.04%；RSD（n=3）為0.37%、0.85%、0.25%、0.42%、1.7%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.7.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試液適量，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h后按色譜條件測(cè)定，測(cè)得峰面積日內(nèi)RSD為0.32%（n=7），表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。每天測(cè)1次，連續(xù)測(cè)5 d，峰面積日間RSD為1.5%（n=5）。

2.7.8回收率試驗(yàn)精密量取0.50 mL空白納米乳15份，分3組，置10 mL容量瓶中，分別加入20 μg/mL辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.40、0.50、1.00 mL，各5份，無(wú)水乙醇定容，超聲混勻，0.45 μm濾過，精密吸取續(xù)濾液20 μL按上述色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果高、中、低濃度平均回收率分別為100.14%、102.56%、107.25%，RSD值分別為1. 30%、0.83%、0.58%（n＝5），見表7。

2.7.9含量測(cè)定精密量取0.004%辣椒堿納米乳0.50 mL，無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL，超聲混勻，得辣椒堿供試液；另精密稱取辣椒堿對(duì)照品適量，無(wú)水乙醇配成2.0 μg/mL辣椒堿對(duì)照液。分別吸取辣椒堿供試液、對(duì)照液20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3個(gè)批號(hào)辣椒堿含量分別為94.50%、94.55%和94.10%。

表7辣椒堿納米乳回收率（略）

Table 7Recovery of capsaicin nanoemulsion

2.8辣椒堿納米乳包封率測(cè)定 包封率測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［13］:量取0.004%辣椒堿納米乳0.3 mL滴到葡聚糖凝膠柱中心，2 000 r/min離心5 min，洗脫液用無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL，超聲混勻，按“2.7.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度。根據(jù)式1-1計(jì)算辣椒堿納米乳的包封率。 包封率＝（ρ包封/ρ總藥）×100% （1-1） 式中ρ總藥表示辣椒堿總質(zhì)量濃度，ρ包封表示納米乳中被包封辣椒堿質(zhì)量濃度。測(cè)得3批辣椒堿納米乳的包封率分別為85.83%、84.50%、85.34%，RSD為0.79%。見表8。

表8辣椒堿納米乳包封率（略）

Table 8Entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion

3討論

3.1影響乳滴粒徑因素

3.1.1油、表面活性劑種類油、表面活性劑種類是影響乳滴粒徑的重要因素。根據(jù)納米乳形成機(jī)理，當(dāng)表面活性劑的親水親油平衡值（HLB）與油所需HLB值相當(dāng)時(shí)，形成納米乳較穩(wěn)定［14］。當(dāng)油、表面活性劑濃度不變，分別以大豆油、油酸乙酯、MCT為油相，形成乳滴粒徑由小到大排列：吐溫80＜泊洛沙姆F68＜豆磷脂。可見，乳化劑乳化能力由強(qiáng)到弱排列：吐溫80＞泊洛沙姆F68＞豆磷脂。同時(shí)，表3結(jié)果也表明，乳滴粒徑隨吐溫80增加、豆磷脂減少而逐漸減小，說明吐溫80乳化能力較強(qiáng)。制備O/W型乳劑，所需乳化劑的HLB值在8～16范圍內(nèi)，吐溫80的HLB值為15.0；而豆磷脂僅3. 0，脂溶性過強(qiáng)，在水相體系中分散性較差，難以在油水兩相中很好的分配；相反，泊洛沙姆F68的HLB值為29.0［12］516-519，親水性強(qiáng)，不能在油水界面大量吸附，也難以形成牢固的界面膜，故乳化能力均較差。 油的種類同樣影響微乳的形成。如表1所示，吐溫80作乳化劑，油酸乙酯或MCT為油相時(shí)均能形成透明微乳，而大豆油不能，這可能與大豆油為長(zhǎng)鏈植物油，較難乳化有關(guān)。依據(jù)文獻(xiàn)［15～18］報(bào)道，油相分子的大小以及碳鏈的長(zhǎng)短影響微乳的形成：油相分子體積越小，對(duì)藥物的溶解能力越強(qiáng)；碳?xì)滏溤蕉痰挠驮侥芮度氡砻婊钚詣┲行纬山缑婺ぃ梦⑷橄鄨D區(qū)域越大。反之，碳?xì)滏溸^長(zhǎng)的油則不易形成微乳。因此，油酸乙酯、MCT較大豆油易乳化。

3.1.2表面活性劑用量當(dāng)油、表面活性劑種類固定時(shí)，表面活性劑用量顯著影響乳滴粒徑的大小。如表2所示，吐溫80∶MCT的質(zhì)量比由1∶1增大到4∶1時(shí)，透光率由0.5%增大到99.6%，可見乳滴粒徑隨表面活性劑用量增大而減小。文獻(xiàn)［19］也說明，納米乳中乳化劑的用量為油量的20%～30%，而普通乳中乳化劑多低于油量的10%。這是因?yàn)榧{米乳乳滴小界面積大，表面能高，需要濃度更高的乳化劑才能有效降低表面能，形成納米乳。但考慮到毒性，在形成納米乳前提下表面活性劑的用量應(yīng)盡可能少。

3. 2影響包封率因素 除了油的種類影響乳滴粒徑以外，油的濃度是影響納米乳包封率的關(guān)鍵因素。當(dāng)MCT由0.15 g增大到1.50 g時(shí)，包封率由20.07%提高到85. 22%。這是因?yàn)楫?dāng)辣椒堿濃度不變時(shí)，增大油的量，乳化劑、助乳化劑按比例增加，藥質(zhì)比隨之提高，使更多藥物溶解在油、乳化劑、助乳化劑組成的均相中，形成均勻透明的溶液；遇水乳化后藥物被包裹的比例隨之提高。此外，表5、表6說明乳化溫度與油、水滴加順序?qū)苯穳A納米乳包封率的影響不大。