【摘要】 目的: 制備包裹有MAGE1Hsp70和SEA的復合抗原的納米乳劑疫苗NE（MHS）（nanoemulsionencapsulated MAGE1Hsp70/SEA）， 評價其抗腫瘤免疫學特性。方法: 采用磁力超聲法制備納米疫苗NE（MHS）， 評價其粒徑、 包裹率及穩定性; NE（MHS）免疫動物， IFNγ ELISPOT和LDH殺傷實驗檢測疫苗激活機體特異性細胞免疫反應情況; 腫瘤攻擊實驗檢測納米乳劑疫苗的抗腫瘤效應。結果: （1）成功制備出粒徑為（20±5） nm的NE（MHS）， 其藥物包裹率為87%， 于4℃放置6個月后或3000 r/min 10 min離心后無分層; （2）與其他組相比， NE（MHS）組小鼠脾淋巴細胞中分泌IFNγ的T細胞數量明顯增多（P<0.05）， CTL對B16MAGE1的特異性殺傷作用明顯增強; NE（MHS）組B16MAGE 1腫瘤成瘤時間長、 成瘤率低。結論: NE（MHS）納米乳劑疫苗具有良好的理化性質， 能夠刺激機體產生強烈的MAGE1特異性的細胞免疫， 能有效預防表達MAGE1的腫瘤細胞攻擊， 是一種很有希望的新型抗腫瘤疫苗。

【關鍵詞】 納米乳劑 腫瘤疫苗 MAGE1 Hsp70 SEA

腫瘤疫苗作為預防腫瘤患者術后復發和轉移的有力手段， 近年來已得到廣泛的研究和應用。目前， 已有多種疫苗進入臨床試驗階段。但是由于腫瘤免疫反應的復雜性， 腫瘤疫苗距成為治療型疫苗并真正走向臨床實際應用尚有距離。考量各方面因素、 綜合各設計方案， 本實驗擬在已有研究的基礎上， 對所構建的腫瘤基因工程納米疫苗進一步改進， 并研究其抗腫瘤免疫學特性， 為疫苗走向臨床前研究打下實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

大豆油、 poloxamer 188、 span 80購自美國Gibco公司。C57BL/6小鼠由第四軍醫大學動物中心提供。MAGE1Hsp70蛋白、 SEA蛋白由本實驗室表達純化制備。轉MAGE1基因的小鼠黑色素瘤細胞由本實驗室葉菁博士構建。ELISPOT檢測試劑盒購自法國DIACLONE公司。

Cytotox96檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 油包水型納米乳劑NE（MAGE1/Hsp70+SEA， MHS）的制備 采用磁力超聲法。具體: 1.0 mg復合抗原（融合蛋白MAGE1/Hsp70與超抗原SEA按摩爾比100∶1混合）、 80 g/L Span20、 180 g/L Pluronic188和0.6 mL大豆油， 雙蒸水調整體積為2.5 mL， 混合均勻得到油相; 在3000 r/min磁力攪拌下， 將油相逐滴加入7.5 mL雙蒸水水相中; 將混合物移至真空高速剪切乳化機上， 在0.7 kpa真空下， 23000 r/min， 高速剪切40 min， 溫度控制在80℃以下; 冰浴下40 kHz超聲5 min， 反復3次， 即得到納米疫苗（0.1 g/L）。用0.22 μm的濾膜過濾除菌后， 于4℃保存。

1.3 NE（MHS）的性質鑒定

1.3.1 形態觀察

將制成的NE（MHS）100倍稀釋于生理鹽水中， 取100 μL滴于400目銅網上， 1 min后吸去上清， 10 g/L磷鎢酸染色1 min， 自然晾干后在透射電子顯微鏡下觀察其形態。

1.3.2 粒徑檢測

將采集的圖象經計算機圖象分析求得NE（MHS）的平均粒徑。

1.3.3 包裹率及穩定性測定

采用SephedexG100凝膠層析法， 洗脫液為PBS， 流速為0.5 mL/min。取NE（MHS） 1.0 mL上柱， 收集游離峰即為游離的MHS。將收集的游離MHS用分光光度計測定A280值。同時制備不同濃度的MHS標準蛋白樣品， 用分光光度計測定其光度值， 并繪制濃度與 光度值的標準曲線。以標準曲線為依據， 計算出NE（MHS）中游離MHS的含量。

包裹率按公式計算: 包裹率=(W總－W游)/W總×100%。（W總為制備時所用MHS的總量， W游為游離的MHS的量）。將制備的NE（MHS）置于4℃冰箱保存6個月后或3000 r/min 10 min離心后， 電鏡觀察納米乳劑形態， 明確其穩定性。

1.4 納米乳劑蛋白疫苗的細胞免疫反應

1.4.1 動物的分組、 免疫和小鼠脾淋巴細胞的分離與活化 取4～6周齡的二級C57BL/6小鼠(H2b)， 雌雄不拘， 體質量(18±2) g， 隨機分為6組， 每組6只。分組情況為: (1)PBS對照組: PBS 0.15 mL/鼠; (2)NE（－）對照組: 空白納米乳劑0.15 mL/鼠; (3)MAGE1Hsp70免疫組: 注射MAGE1Hsp70融合蛋白14 μg（150 pmol/L）; (4)NE（MAGE1Hsp70）免疫組: 注射納米乳劑包裹的MAGE1Hsp70融合蛋白疫苗14 μg（150 pmol/L）; (5)MAGE1Hsp70/SEA免疫組: 注射MAGE1Hsp70融合蛋白14μg（150 pmol/L）和SEA蛋白0.042 μg（1.5 pmol/L）; (6)NE（MHS）免疫組: 注射納米乳劑包裹的MAGE1Hsp70/SEA復合蛋白疫苗14 μg（150 pmol/L）。各組分別在1 d、 11 d和21 d腹腔注射免疫， 注射體積均為每次150 μL/鼠。末次免疫后10 d， 無菌取小鼠脾臟， Ficoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。

1.4.2 分泌IFNγ的MAGE1特異性T細胞的檢測（IFNγ ELISPOT）

分別以所獲得的小鼠脾淋巴細胞為效應細胞， 分別以轉染MAGE1陽性的B16細胞和未轉染MAGE1的B16細胞為靶細胞， 每組同時設立不加靶細胞的陰性對照孔和PHA刺激陽性對照孔。用抗小鼠IFNγ的底層抗體包被PVDF板， 反應孔加入按20∶1比例的效應細胞和靶細胞， 37℃反應20 h后洗滌并加上層抗體及酶標二抗。避光顯色20 min， 蒸餾水沖洗終止反應。1200 dpi掃描讀取斑點數。用實驗孔斑點數減去陰性對照孔斑點數后求出每組的平均值。

1.4.3 細胞毒性試驗（Cytotox 96， Promega）

以小鼠的脾淋巴細胞為效應細胞， 以轉染MAGE1陽性的B16細胞和未轉染MAGE1的B16細胞為靶細胞， 按效靶比(E∶T ratio) 2.5∶1、 5∶1、 10∶1混合2組細胞， 37℃培養4 h后采用LDH法檢測殺傷率。

1.5 腫瘤攻擊實驗

C57BL/6小鼠60只， 雄性， 隨機分為6組， 每組10只。小鼠腹腔注射疫苗， 分組及免疫劑量同實驗1.4.1， 分別于首次免疫后7 d、 14 d后以相同劑量追加免疫2次。末次免疫后7 d于小鼠右后肢皮下接種1×105 B16MAGE1細胞。觀察并記錄小鼠成瘤率， 繪制KaplanMayerr曲線。

1.6 統計學處理

所有數據的統計和分析采用SPSS11.5軟件進行， 組間比較采用方差分析， P<0.05為組間具有統計學意義。KaplanMayer存

2 實驗結果

2.1 納米疫苗NE（MAGE1Hsp70/SEA）的性質

納米乳劑為乳白色的均質膠體混懸液， 在透射電子顯微鏡下觀察發現納米乳劑呈球形（圖1）， 大小較均勻， 將采集的圖象經計算機圖象分析得出納米乳劑平均粒徑為(20±5) nm。經計算得出， 包裹率為87%。于4℃放置6個月或3000 r/min 10 min離心后， 外觀依然為均質膠體混懸液， 無分層和沉淀現象。電鏡觀察顆粒大小無變化。

2.2 ELISPOT檢測脾淋巴細胞IFNγ釋放細胞數量

B16MAGE1為靶細胞時， MH、 NE（MH）、 MHS和NE（MHS）組均有特異性T淋巴細胞， 與空白NE組、 PBS組相比， IFNγ釋放細胞頻數有統計學意義; 其中NE（MHS）組免疫的小鼠脾淋巴細胞中針對MAGE1的特異性T細胞的數量高于MHS組（P<0.01）， NE（MH）組高于MH組（P<0.01）， MHS組高于MH組、 NE（MHS）組高于NE（MH）組（P<0.05）。以B16為靶細胞時， 各組均可見少量非特異分泌IFNγ的細胞（圖2）。

2.3 細胞毒性實驗

在效靶比為2.5∶1、 5∶1和10∶1的情況下， PBS組、 NE（）組脾淋巴細胞對B16MAGE1細胞無殺傷作用; MH組、NE（MH）組、 MHS組和NE（MHS）組脾淋巴細胞對B16MAGE1細胞的特異性殺傷作用均高于PBS組、 NE（）組， 而且NE（MH）組、 NE（MHS）組特異性殺傷作用分別明顯大于MH組、 MHS組， 說明以納米乳劑為藥物載體包裹融合蛋白或復合蛋白后， 對表達MAGE1的腫瘤細胞的特異性殺傷作用明顯強于未包裹MH、 MHS疫苗， 能誘導產生較未包裹MH、 MHS疫苗更強的特異性CTL; 6組中以NE（MHS）組免疫的小鼠脾淋巴細胞特異性殺傷能力為最高。各組對B16的殺傷能力均低（圖3A、 B）。

2.4 納米疫苗對腫瘤攻擊鼠的保護效果

PBS組和NE（）組的小鼠均在10 d內成瘤; 21 d時， MH組10只小鼠全部成瘤， MHS組和NE（MH）成瘤小鼠分別為7只和3只， 而NE（MHS）組10只小鼠中均無腫瘤生長; 32 d時， NE（MH）組和NE（MHS）成瘤小鼠分別為6只和3只， 而其他組10只小鼠均成瘤; NE（MHS）組最后1只小鼠的成瘤時間為56 d?？梢奛E（MHS）對表達MAGE1抗原腫瘤攻擊的小鼠有明顯的保護效果（圖4）。

3 討論

ELISPOT和LDH釋放實驗結果顯示， 經納米乳劑包裹的NE(MHS)、 NE(MH)疫苗免疫的小鼠脾淋巴細胞中MAGE1特異性T細胞數量分別較未包裹的MHS、 MH裸蛋白明顯升高， NE（MHS）與NE（MH）相比， 以前者為最高; NE（MHS）免疫的小鼠誘導的CTL對B16MAGE1的特異性殺傷率明顯大于MHS蛋白疫苗， NE（MH）大于MH， NE（MHS）大于NE（MH）， 證實與其他組相比， 納米乳劑包裹的MHS復合蛋白疫苗能誘導最強的MAGE1特異性的細胞免疫反應， 其作用明顯強于未經包裹的復合蛋白疫苗和未加入SEA的NE（MH）蛋白疫苗。腫瘤攻擊實驗顯示納米乳劑復合抗原疫苗NE（MHS）能有效延遲B16MAGE1瘤細胞對小鼠攻擊的成瘤時間、 降低成瘤率。 納米乳劑疫苗取得上述良好免疫效果， 主要原因分析如下: 一是選擇腫瘤特異性抗原MAGE1為疫苗的核心。腫瘤疫苗發揮關鍵作用的成分是腫瘤抗原。MAGE1是到目前為止經實驗證實的具有良好激活機體抗腫瘤免疫反應的少數腫瘤特異性抗原（TSA）之一。MAGE1不僅在黑色素瘤表達， 同時在其他多種腫瘤中均有不同程度的表達， 但在除睪丸和胎盤外的正常組織中均不表達， 故成為腫瘤特異性免疫治療理想的靶分子[1， 2]。二是采用Hsp70MAGE1融合蛋白， 利用Hsp70的分子伴侶作用加強APC細胞對抗原的加工遞呈， 從而有效增強腫瘤疫苗的抗腫瘤免疫效果。我們以往的實驗結果顯示[3， 4]， Hsp70能夠增強MAGE1Hsp70融合基因疫苗和MAGE3Hsp70融合蛋白疫苗的CTL效應; 將Hsp70與腫瘤抗原融合表達的融合蛋白是二者聯合使用的最有利形式。三是加入超抗原SEA可有效激活CD4+T細胞， 協同加強腫瘤抗原的免疫效果。在機體抗 腫瘤免疫反應的過程中， 僅有CD8+T的激活并不能起到有效的殺傷腫瘤作用， CD4+T細胞的參與是必不可少的。超抗原葡萄球菌腸毒素A（SEA）是一種具有強大免疫激活性能的超抗原， 可以有效激活CD4+T細胞， 進而激活CTL， 導致對腫瘤細胞的殺傷， 具有高效免疫活性。研究結果顯示， pg級的SEA即可引發高效的免疫激活效應[5]， 動物實驗顯示可有效激活系統和腫瘤局部的免疫活性， 抑瘤效果明顯， 荷瘤動物的生存期明顯延長， 且未觀察到明顯的毒副作用和免疫耐受現象的出現[6]。我們的研究還發現， 將超抗原SEA以1∶100的比例與MAGE1腫瘤抗原混合， 即可誘發高效的針對表達該抗原的腫瘤細胞的免疫排斥反應， 同時， 由于用量極低， 尚可有效避免毒性和免疫耐受的出現。四是選擇納米乳劑為疫苗載體， 充分發揮納米藥物載體的優良特性。(1)納米乳劑保護、 緩釋腫瘤抗原， 進而增強其生物利用度。特別是油包水型（W/O）納米乳劑 ， 其外油層表面具有隔斷和保護內容物免遭酶及體液的破壞作用， 隨著油相脂解， 包裹在里面的蛋白質緩慢釋放。這種緩釋作用持續刺激免疫系統， 生物利用度相應提高。(2)納米乳劑可促進APCs提呈抗原。我們的實驗證實[7]， 用納米乳劑包裹模式蛋白BSA的體外細胞攝取實驗中已發現， 載藥納米乳劑可明顯增強DC和巨噬細胞對所載藥物的攝取。(3)納米乳劑具有親淋巴系統被動靶向特性[8]。有實驗證實， 納米乳劑經局部注射后能定向進入淋巴循環， 聚集在區域淋巴結內; 經淋巴引流的納米乳劑還可刺激局部淋巴結淋巴細胞增殖產生特異性免疫應答; (4)納米乳劑乳化過程溫和， 不會改變多肽類藥物的生物活性; 且所用成分均為生物材料， 低毒、 安全[9]。

腫瘤的低免疫原性和機體的低免疫反應性大多數情況下在同一機體是同時存在的， 腫瘤免疫治療想取得預期的治療效果， 必須從多方面綜合入手。設計者需同時考慮到調動機體的特異和非特異免疫， 激活CD8+和CD4+T細胞以及改善APC細胞抗原提呈功能、 增加疫苗的生物利用度等多方面因素[10]。在本實驗制備的腫瘤基因工程納米疫苗可以增強所載抗原的生物利用率， 促進抗原的攝取提呈， 增強機體的抗腫瘤免疫反 應， 是一種高效的腫瘤疫苗。