作者：朱昌來，李峰，尤慶生，陸松華，王慶慶，林琳，張天一

【摘要】 制備細菌纖維素，觀察納米細菌纖維素的超微結構特點。用紅茶菌做菌種，通過茶水發酵培養制備納米細菌纖維素，利用掃描電鏡、透射電鏡觀察其超微結構特點。結果表明：新鮮制備的細菌纖維素膜為無色透明膠凍狀膜，表面光滑；經預處理后呈乳白色半透明膠凍狀；掃描電鏡下可見細菌纖維素膜呈疏松的網狀結構，纖維素微纖絲從菌體胞壁小孔中分泌出來；透射電鏡下，經負染后，在深色的背景中間可見淺色細絲狀。說明細菌纖維素具有良好的納米纖維網絡特征，在生物醫學領域具有良好的、廣泛的應用前景。

【關鍵詞】 納米材料；細菌纖維素；超微結構；組織工程；電子顯微鏡

Abstract：To prepare the biomaterial bacterial cellulose (BC) and observe the characteristic of its ultra-structure. Red-tea fungus was used as the culturing strain， and nanometer biomaterial BC produced through fermentation of tea， then the ultra-structure of nanometer biomaterial BC was observed by SEM and TEM. Results showed that BC membranes that fresh prepared was smooth、colorless and jel alike and it showed translucence after pre-disposal treatment. The surface of BC membranes was porous network structure observed by SEM， and the micro-fibrils of BC were secreted from the eyelet of cell wall. Tint fine thread could be found in dark background after negative staining observed by TEM.It proves that BC has fine nano fibre-network， which has extensive usage in biomedicine areas.

Key words：Nanometer material；Bacterial cellulose；Ultra-structure；Tissue engineering；Eletron microscope

1 引 言

細菌纖維素 (bacterial cellulose，BC)是由微生物（主要為細菌）發酵形成的一類纖維素，是葡萄糖以β-1，4-糖苷鏈連接形成的高分子化合物，它與植物纖維素化學組成非常相似，因其在吸水性、物理和機械性能等諸多方面的優良性能，在醫藥、生物醫學工程、造紙和食品工業等領域中具有廣泛的應用前景，是國際生物醫用材料研究的熱點之一。本研究用紅茶菌做菌種，通過茶水發酵制備納米細菌纖維素，同時通過對掃描和透射電鏡下細菌纖維素的結構的觀察，深入了解其納米級的結構特點。

2 材料和方法

2.1 材料

紅茶菌菌種 (購自黑龍江黑河)、葡萄糖（AR）、蔗糖（AR）、乙醇（食用級）、蛋白胨、市售綠茶。掃描電子顯微鏡（ S-3400N，Hitachi），透射電子顯微鏡（JEM-1230，JEOL）。

2.2 方法

2.2.1 基礎發酵培養基的配制 按綠茶(干基):糖:水=0.5:100:1000，先將水煮沸，加入綠茶浸泡于85～90 ℃溫度，保持20 min，濾去茶葉渣得到綠茶汁，按比例加入溶化的糖水（其中葡萄糖和蔗糖的比例為1：1），再加入0.5 %蛋白胨、1 %乙醇（V/V），混勻后分裝到三角瓶中，每500 ml裝入200 ml 糖茶水，用牛皮紙包扎，巴氏消毒后冷卻到室溫備用。

2.2.2 接種培養 紅茶菌菌種放入消過毒的淺盤中，倒入適量基礎發酵培養基，在30℃恒溫條件下靜止培養7天。

2.2.3 細菌纖維素的提取和處理 恒溫靜置培養7 d后，生成細菌纖維素膜浮于液面。膜取出后，用蒸餾水多次沖洗，除去膜表面培養基及雜質。再將膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100 ℃煮沸20 min，去除液膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明。將以上制得的細菌纖維素膜置于裝有生理鹽水的燒杯中，以121 ℃ 高壓消毒20 min備用。

2.2.4 納米細菌纖維素超微結構觀察 取納米細菌纖維素膜1 cm2左右，干燥后直接于離子濺射儀上噴鍍金屬鉑，然后在SEM下觀察標本結構；將納米細菌纖維素經超聲粉碎后制成纖維素懸液，經4%磷鎢酸負染后于TEM下觀察。

3 結果與討論

3.1 恒溫靜置培養7d后，生成細菌纖維素膜，經提取和預處理后呈乳白色半透明膠狀液膜，外表均勻光滑，有一定的張力，見圖1。

3.2 SEM下觀察細菌纖維素膜的表面結構特征

在掃描電鏡下可見菌體呈桿狀，細菌纖維素膜表面菌體及從菌體胞壁小孔中分泌出來的纖維素微纖絲；細菌纖維素細絲為納米級，大量的納米纖維相互交織形成不規則疏松的網狀結構。見圖2、3。

3.3 經負染后在TEM下觀察到的細菌纖維素結構

細菌纖維素膜經超聲粉碎，負染后于透射電鏡下可見在深色條狀深染背景中有透明細絲狀纖維絲，纖維絲仍交織成網狀，見圖4。

4 討論

細菌合成纖維素是Brown 1886年首次報道的。他發現木醋桿菌（Acetobacter xylinum）在靜止培養時，于培養基表面形成一層白色纖維狀物質。經化學與物理方法分析，確定此類物質具有纖維素的結構與化學性質，因其屬細菌合成而命名為細菌纖維素。有文獻報道［1］產纖維素的細菌主要為木醋桿菌，細菌細胞壁側有一列50～80個軸向排列小孔，在適宜條件下，每個細胞每秒鐘可將1.5×108個葡萄糖分子以β-1， 4-糖苷鍵相連成聚葡糖，從小孔中分泌出來，形成直徑1.78 nm左右的纖維素微纖 絲（cellulose microfibrils），并隨分泌量的持續增加平行向前延伸。相鄰的幾根微纖絲之間通過氫鍵相互連接，形成直徑３～４ nm的微纖束（Bundle）。微纖束進一步伸長，相互纏繞，多束合并形成一根長度不定、寬30～100 nm、厚3～8 nm的細菌纖維條（Ribbon），其直徑和寬度僅為棉纖維的1/100～1/1000，是已知纖維中最細的。纖維條互相交織，形成不規則網狀或絮狀多孔結構，在液面形成凝膠狀菌膜。除木醋桿菌外，能夠產生BC的細菌主要還有Acetobacter，Rhizobium，Agrobacterium，和Sarcina等［2］。

用于發酵培養紅茶菌的菌種主要是醋酸菌和酵母菌，有的紅茶菌種中含有少量乳酸菌［主要是保加利亞乳桿菌(Lactobacterium bulagricum)］。酵母菌和醋酸菌在紅茶菌中是相互依賴的共生關系，因為在發酵開始階段，醋酸菌生長所需要的葡萄糖、果糖和乙醇由酵母菌將蔗糖降解生成；而醋酸菌產生的乙酸又會刺激酵母菌產生乙醇，而乙酸、乙醇的存在可保護醋酸菌和酵母菌，使其免受其它微生物的侵染［3］。成膜后，由于經過堿處理及清洗，膜上已不會有殘留的酵母菌等成分。由于紅茶菌中成分相對復雜，用其培養獲得的細菌纖維素在其結構尤其是在機械性能上可以彌補從單一的木醋桿菌中獲取纖維素存在的不足，故在組織工程研究中利用紅茶菌來獲取細菌纖維素可能更好；尤其在營養保健方面，紅茶菌更具有其獨特的科學利用價值。

本研究通過掃描電鏡觀察證實，細菌從菌體胞壁小孔中分泌纖維素微纖絲，細菌纖維素條相互交織形成的不規則疏松的網狀結構，肉眼觀下的膜狀結構是由高密度微纖維相互纏繞形成。透射電鏡下觀察細菌纖維素的結構，鮮有文獻報道，本研究將纖維素膜結構在超聲粉碎經負染后，通過透射電鏡下觀察也表明，這些膜結構是由超微纖維組成的超微纖維網，同掃描電鏡下所見的結構相同。

由于細菌纖維素具有優秀的生物相容性和良好的生物可降解性，其在生物醫學領域有著廣泛的應用。在人工血管方面，Henrik等研究了細菌纖維素作為潛在的組織工程血管支架的機械性能，并比較了細菌纖維素、豬動脈血管以及膨體聚四氟乙烯( ePTFE)支架在機械性能上的差異，結果表明細菌纖維的應變能力與動脈血管相似，這很可能是由于納米纖維結構的相似性造成的［4］。而BC在人工皮膚的研究中也取得重要進展。Sanchavanakit等［5］利用人類角化細胞和成纖維細胞來評價BC膜的潛在生物作用機理，研究結果直接證明了BC 膜支持人類角化細胞的生長、增生和移動，但是對成纖維細胞沒有作用。BC在組織工程支架中的應用上，Helenius等［6］從慢性炎癥反應、異物排斥反應以及細胞向內生長和血管生成等方面的特征來評價植入物的體內相容性。結果發現植入物周圍無肉眼和顯微鏡可見的炎癥反應，沒有纖維化被膜和巨細胞生成，未引起任何慢性炎癥反應。因此，可以斷定BC的生物相容性非常好，在組織工程支架構建方面具有潛在價值。

細菌纖維素的產量較低，制約了其應用，有研究表明通過攪拌或振蕩培養有利于細菌菌體的生長，提高攪拌速度至一個合適的范圍，可以顯著提高纖維素產量［7］，本實驗通過相應的改進措施，獲得了較高的納米細菌纖維素產率，為進一步研究提高了基礎。

本研究以紅茶菌為菌種，通過茶水發酵分離制備納米細菌纖維素的方法同傳統方法相比，操作簡單，成本低廉，為將來細菌纖維素的大規模生產提供了一條新途徑。