【摘要】 自然界在駱駝體內存在缺失輕鏈的重鏈抗體， 克隆其可變區得到的單域抗體是最小的功能性抗原結合片段， 相對分子質量（Mr）僅為15000， 稱為納米抗體， 具有Mr小、 穩定性強、 可溶性好、 易表達， 免疫原性低等特點。這種小型化的基因工程抗體在基礎研究、 開發新藥和疾病的診斷和治療上具有廣闊的應用前景。

【關鍵詞】 納米抗體 重鏈抗體 VHH

抗體技術已被廣泛地應用于疾病的診斷及治療中， 新型基因工程抗體不斷出現， 包括嵌合抗體、 人源性抗體等。抗體小型化是抗體基因工程研究的主要研究方向之一， 如一些單價小分子抗體scFv， 但在穩定性、 表達產量、 蛋白酶抵抗性和聚合性方面仍有待改進。 1989年， Ward等研制出由重鏈可變區（VH）組成的抗原結合片段， 命名為單域抗體或dAbs。然而， 其抗原親合力低，易聚合。1993年， Hamers-Casterman等［1］報道駱駝的功能性抗體都由重鏈組成， 天然缺失輕鏈， 即重鏈抗體（HCAbs）。克隆重鏈抗體的可變區得到只由一個重鏈可變區組成的單域抗體稱為VHH抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody， VHH)， 晶體結構直徑2.5 nm、長4 nm， 因此稱為納米抗體。在這里我們對其獨特的生物物理性質及其應用做一闡述。

1 納米抗體的結構特征 納米抗體具有完整的抗原結合片段。駱駝的HCAbs具有獨特的重鏈可變區（VHH），一個鉸鏈區和兩個恒定區（CH2和CH3）。恒定區CH1是與輕鏈錨定的部位， 在納米抗體的基因組中存在， 但在mRNA形成中被剪切掉， 所以納米抗體缺乏輕鏈［2］。因此， 納米抗體靠僅有的3個CDRs就具備了特異的抗原結合能力和高親合力， 而普通抗體則需要6個CDRs。 納米抗體的晶體和水溶性結構由2個β片層組成支架， 類似普通抗體的VH免疫球蛋白折疊。納米抗體的抗原結合環的結構組成比普通抗體VH更大， CDR3區也更長。人和小鼠VH的CDR3平均長度分別為12和9個氨基酸， 而納米抗體則為16～18個氨基酸。納米抗體包含了骨架區（framework region， FR）的氨基酸殘基， 因此納米抗體能補償抗原結合位點VL的缺乏。普通抗體的FR2中， V37， G44， L45和W47這4個氨基酸殘基參與VL的相互作用， 而在納米抗體中， 這幾個氨基酸殘基發生了改變， 突變為F37， E44， R45， G47， 由疏水性變為親水性， 使納米抗體更易于溶解［3］。利用這一特點， 對人源抗體VH結構域FR2中的一些氨基酸進行VHH特征性改造， 即在人VH區的44、 45和47位點氨基酸殘基用納米抗體中相對應的代替， 所得到的駱駝化單域VH抗體不僅保持原有抗體的特異性和親和力， 且溶解性好、 穩定性好［4］。基因工程化納米抗體結構的穩定性和可溶性還與CDR長度和多樣性相關的突變有關。 比較人類VH3基因序列與駱駝的VHH胚系基因序列， 發現二者有高度的同源性。另外， 在小鼠B或T細胞缺乏對納米抗體的免疫應答。因此， 帶有人VHFR2烙印的納米抗體的建立可能是獲得非免疫原性納米抗體的方法。

2 納米抗體的特性 納米抗體的單域性質使其較普通抗體具有一些獨特的性質。

2.1 容易制造和表達 納米抗體是Mr為15000的單域蛋白。重組納米抗體通常在E.coli中表達量為10 mg/L。從真菌和酵母中能高水平分泌納米抗體， 在振蕩培養的酵母菌（saccbaromyces cerevisiae）中產量為100 mg/L， 而10 L的補料發酵方法能獲得大于1 g/L的產量。從15 m3的發酵中可以獲得大于1 kg的納米抗體［5］。

2.2 納米抗體的高水溶性和穩定性 VH結構域單獨表達時通常形成包涵體， 或者暴露的疏水域相互黏附。由于在納米抗體中FR2中的疏水殘基被親水殘基代替， 納米抗體水溶性增加， 聚合性減少， 即使以包涵體形式表達， 納米抗體也很容易復性。 一些納米抗體能耐高溫且具有高度的構像穩定性。在37℃孵育1周后納米抗體仍具有80%的結合活性。另外， 它具有可逆的去折疊能力， 將它長期放在高于90℃的環境后仍能重新獲得抗原結合能力［6］。納米抗體的熔點在60～78℃［7］， 而其他的抗體及其片段常會在熱變性后不可逆的聚合。納米抗體還顯示出在離液劑［7］、 存在蛋白酶和極度pH值下的變性效應下具有高度穩定性。因此， 在苛刻的條件中納米抗體能保持穩定性， 如胃液和內臟中， 為口服治療胃腸道疾病提供新的思路。

2.3 納米抗體識別獨特的構造表位 納米抗體比普通抗體有更廣泛的抗原結合能力， 從小分子的半抗原和肽， 到大分子的蛋白和病毒。甚至當靶蛋白緊密包裹隱藏了普通抗體識別的位點時， 小分子的納米抗體也可以對其進行表位識別［8］。納米抗體的CDR3區可以形成一個大的暴露的凸環， 凸環中的二硫鍵使其結構穩定， 這個長CDR3環能結合蛋白空間構像上的裂隙和空腔 ，參與大部分抗原結合反應。所以， 從納米抗體中可以容易地找到酶的抑制劑、 受體的激動劑或拮抗劑等。普通抗體的抗原結合表面常形成一個凹面或平面， 與抗原作用后會被固定， 在結合能上產生陰性反應（熵效應）。駱駝納米抗體的長CDRs環大部分折疊在FR2上， 在這里疏水殘基受保護，避免與外界水性環境接觸。另外， CDR3環包含一個半胱氨酸， 與CDR1（或45位點）形成二硫鍵。這種二硫鍵的存在能夠穩定CDR3形成的凸環結構， 從而降低與抗原的結合能［9］。

3 納米抗體的應用價值 納米抗體具有獨特的性質如Mr小、 水溶性好、 穩定性強、 抗原識別能力強、 易于生產等。因此在生物技術和醫學應用方面， 比其他抗體具有優越性。

3.1 納米抗體用于構建多種分子結構 雙特異性和雙功能抗體在免疫診斷和治療上有許多實用性。雙特異性抗體能結合一個靶抗原的相鄰的兩個位點， 從而獲得對抗原的高親合力。雙功能抗體能傳遞毒性載體， 如放射性核素、 細胞毒性藥物等到靶抗原， 包括癌細胞。這種多特異性分子的理想性質是: 小分子、 高水溶性、 高穩定性、 缺乏聚合或蛋白水解傾向、 高表達產量。以scFv構建的雙特異性和雙功能抗體， 表達水平低、 易聚合和被蛋白水解， 阻礙了大規模的臨床發展。 納米抗體的嚴格單域本質， 高水溶性和高穩定性， 構造的雙功能或二價體蛋白在細菌中能高表達， 完全保留原有的功能。Zhang等［10］將從天然納米抗體庫中篩選的單域納米抗體五聚化， 極大地提高了與抗原的親和力。五聚體納米抗體表現出良好的熱力學穩定性以及不易被蛋白酶所降解等特性。 將酶或毒素蛋白的基因與納米抗體的基因融合可產生一些免疫毒性和其他免疫交聯物。使其在組織穿透力、 清除速度以及穩定性上比其他抗體更具優勢。S-layer(晶體細菌表面蛋白)蛋白和納米抗體的基因融合產生的融合蛋白能自發的結晶為單體性蛋白晶格， 作為納米模式的感覺層用于檢測低濃度抗原［11］。 一種基因工程改造的載脂蛋白I能治療羅德西亞布氏錐蟲病， Toya等［12］將能識別錐蟲病各種表面糖蛋白的隱藏位點的納米抗體與之結合， 在小鼠能有效的治愈該病，并緩解急慢性感染。

3.2 納米抗體作為穩定內在易變或不穩定蛋白的模式 D67H變異體是一個自然形成的突變體， 產生在系統性神經性淀粉樣變， 對人淀粉樣變的特異性納米抗體在體外能使之形成部分非折疊的形式， 顯著抑制其聚合。為治療蛋白沉淀疾病設計合理的藥物提供了一個新的方法［13］。納米抗體與一種內在易變蛋白， 成癮解毒劑MazE結合后， 能穩定抗原， 保持其晶體結構［14］。

3.3 納米抗體作為細胞內抗體 抗體的細胞內表達是體外抑制目標分子功能的重要工具。事實上， 大部分抗體沒有細胞內功能， 因為在細胞質還原環境中不能形成二硫化合物， 或者靶向亞細胞部位比較困難。而且， 很少有抗體能結合到酶的活性位點， 因此， 它們一般不能中和酶的活性。Jobling等［15］證明了納米抗體能正確的靶向亞細胞組分， 在植物中比反義實驗更能有效的抑制酶的功能。因為納米抗體通常比scFv更穩定， 甚至在細胞質還原環境中能更好的維持其抗原結合能力。細胞內表達的納米抗體與豬的內源性逆轉錄病毒Gap多肽的p15基質蛋白結合能阻止豬內源性病毒的產生［16］。Aires da Silva等［17］將針對HIV-1的Vif蛋白的scFv的VH區進行了VHH特征性改造， 發現改造后的抗體在細胞內能有效表達， 并具有很好的溶解性， 能夠與Vif蛋白結合， 中和HIV-1病毒的感染。另外， 內抗體也可能用于阻斷細胞內的信號通路。

4 納米抗體在腫瘤的診斷和治療中的應用

4.1 納米抗體作為腫瘤的診斷工具 疾病早期快速而便捷的體外診斷和監測治療效果， 是癌癥診斷中的一個主要難題。理想的癌癥成像介質具有滲透性好， 非特異性噪聲背景低， 未結合的能迅速從系統清除以減少靶向-本底比值。單克隆抗體(mAb)顯影劑組織穿透性差， 不易清除。納米抗體與靶結合位點的高親合力， 能快速清除多余非結合納米抗體， 具有優良的穿透能力。識別溶菌酶的納米抗體， 在體外能抑制溶菌酶的活性， 同時能有效靶向大塊的腫瘤和轉移性兵變， 而多余未結合的納米抗體能迅速的從周圍正常組織中清除。放射性標記的納米抗體給藥后數小時， 腫瘤-血流比值上升到10［17］。還可將半衰期短的放射性核素， 如99mTc和123I， 標記納米抗體后進行腫瘤成像。 前列腺癌的早期檢測和分期是基于在血流中的前列腺特異性抗原（PSA）的檢測。然而， 血液中存在PSA的不同亞型。Saerens等［18］發現納米抗體能區別不同亞型的PSA， 可用于區別不同階段的前列腺癌。納米抗體還是免疫細胞化學中很好的工具， 也可在免疫組化和免疫印跡檢測眼咽肌肉疾病。

4.2 納米抗體在腫瘤治療中的用途 由于納米抗體的高親合力和特異性， 小分子的納米抗體尤其適合在梗阻部位靶向結合抗原， 能滲入血管少的組織。而且，納米抗體的免疫原性很低， 在動物實驗中， 納米抗體的重復給藥未檢測到任何體液和細胞免疫反應［19］。 由于納米抗體可以用于構建多種分子結構， 可以傳輸一些分子為治療提供輔助功能。如傳遞毒性有效載荷到腫瘤組織， 而減少毒性化合物對健康細胞的損傷。將納米抗體直接結合在癌胚抗原和一個細菌β內酰胺酶之間， 構建雙功能融合蛋白， 能完全治愈LS174T人腺癌異種移植物，而沒有任何副作用［19］。 經遺傳修飾的細菌作為自殺基因載體可以選擇性地破壞腫瘤細胞。為提高這些細菌定向腫瘤的能力， 可以將靶向分子如抗體表達在其表面。由于納米抗體的高度穩定性和低聚合傾向， 納米抗體為基礎的多種結構能有效的轉位到細菌細胞表面。 穿過血腦屏障的治療仍然是神經性疾病和腦腫瘤治療中的一個主要課題。納米抗體能穿過人血腦屏障內皮細胞， 通過表達在腦毛細血管受體傳遞大分子穿過血腦屏障向細胞內轉移［20］。 納米抗體作為細胞內抗體， 能夠中和或調節位于特定亞細胞部位的原癌基因分子的活性， 或者觸發抗腫瘤免疫。通過建立腫瘤細胞免疫的納米抗體庫， 篩選腫瘤細胞特異性的納米抗體， 利用納米抗體識別腫瘤細胞表面抗原， 從而得到腫瘤治療靶標。 在治療時不僅希望藥物能快速清除， 也希望能延長血清半衰期以增加抗體與靶點的作用時間， 減少用藥劑量。一些方法能增加抗體的半衰期， 如聚乙二醇化（PEGylation）， 與白蛋白結合或融合， 與抗體的Fc融合。新生受體FcRn能調節IgG和白蛋白的半衰期。這些方法也將能用于增加納米抗體的血清半衰期。

5 結語 納米抗體從發現至今， 已經發展為有廣泛生物應用價值和臨床應用價值的高度通用分子。納米抗體有來源于成年駱駝體內HCAbs的最小的功能性抗原結合片段， 具有高度穩定性和與抗原結合的高親合力， 能與蛋白裂隙和酶活性位點的相互作用， 使之作用類似于抑制劑。因此， 納米抗體可以為從肽模擬藥物設計小分子酶抑制物提供新的思路。由于僅有重鏈， 納米抗體的制造較mAb容易。納米抗體的獨特性質， 如處于極端溫度和pH環境中的穩定性， 可以低成本制造大產量。因此， 納米抗體在疾病的治療和診斷中具有很大的價值， 在腫瘤的抗體靶向診斷和治療中也具有很大的發展前景。

3.3 納米抗體作為細胞內抗體 抗體的細胞內表達是體外抑制目標分子功能的重要工具。事實上， 大部分抗體沒有細胞內功能， 因為在細胞質還原環境中不能形成二硫化合物， 或者靶向亞細胞部位比較困難。而且， 很少有抗體能結合到酶的活性位點， 因此， 它們一般不能中和酶的活性。Jobling等［15］證明了納米抗體能正確的靶向亞細胞組分， 在植物中比反義實驗更能有效的抑制酶的功能。因為納米抗體通常比scFv更穩定， 甚至在細胞質還原環境中能更好的維持其抗原結合能力。細胞內表達的納米抗體與豬的內源性逆轉錄病毒Gap多肽的p15基質蛋白結合能阻止豬內源性病毒的產生［16］。Aires da Silva等［17］將針對HIV-1的Vif蛋白的scFv的VH區進行了VHH特征性改造， 發現改造后的抗體在細胞內能有效表達， 并具有很好的溶解性， 能夠與Vif蛋白結合， 中和HIV-1病毒的感染。另外， 內抗體也可能用于阻斷細胞內的信號通路。

4 納米抗體在腫瘤的診斷和治療中的應用

4.1 納米抗體作為腫瘤的診斷工具 疾病早期快速而便捷的體外診斷和監測治療效果， 是癌癥診斷中的一個主要難題。理想的癌癥成像介質具有滲透性好， 非特異性噪聲背景低， 未結合的能迅速從系統清除以減少靶向-本底比值。單克隆抗體(mAb)顯影劑組織穿透性差， 不易清除。納米抗體與靶結合位點的高親合力， 能快速清除多余非結合納米抗體， 具有優良的穿透能力。識別溶菌酶的納米抗體， 在體外能抑制溶菌酶的活性， 同時能有效靶向大塊的腫瘤和轉移性兵變， 而多余未結合的納米抗體能迅速的從周圍正常組織中清除。放射性標記的納米抗體給藥后數小時， 腫瘤-血流比值上升到10［17］。還可將半衰期短的放射性核素， 如99mTc和123I， 標記納米抗體后進行腫瘤成像。 前列腺癌的早期檢測和分期是基于在血流中的前列腺特異性抗原（PSA）的檢測。然而， 血液中存在PSA的不同亞型。Saerens等［18］發現納米抗體能區別不同亞型的PSA， 可用于區別不同階段的前列腺癌。納米抗體還是免疫細胞化學中很好的工具， 也可在免疫組化和免疫印跡檢測眼咽肌肉疾病。

4.2 納米抗體在腫瘤治療中的用途 由于納米抗體的高親合力和特異性， 小分子的納米抗體尤其適合在梗阻部位靶向結合抗原， 能滲入血管少的組織。而且，納米抗體的免疫原性很低， 在動物實驗中， 納米抗體的重復給藥未檢測到任何體液和細胞免疫反應［19］。 由于納米抗體可以用于構建多種分子結構， 可以傳輸一些分子為治療提供輔助功能。如傳遞毒性有效載荷到腫瘤組織， 而減少毒性化合物對健康細胞的損傷。將納米抗體直接結合在癌胚抗原和一個細菌β內酰胺酶之間， 構建雙功能融合蛋白， 能完全治愈LS174T人腺癌異種移植物，而沒有任何副作用［19］。 經遺傳修飾的細菌作為自殺基因載體可以選擇性地破壞腫瘤細胞。為提高這些細菌定向腫瘤的能力， 可以將靶向分子如抗體表達在其表面。由于納米抗體的高度穩定性和低聚合傾向， 納米抗體為基礎的多種結構能有效的轉位到細菌細胞表面。 穿過血腦屏障的治療仍然是神經性疾病和腦腫瘤治療中的一個主要課題。納米抗體能穿過人血腦屏障內皮細胞， 通過表達在腦毛細血管受體傳遞大分子穿過血腦屏障向細胞內轉移［20］。 納米抗體作為細胞內抗體， 能夠中和或調節位于特定亞細胞部位的原癌基因分子的活性， 或者觸發抗腫瘤免疫。通過建立腫瘤細胞免疫的納米抗體庫， 篩選腫瘤細胞特異性的納米抗體， 利用納米抗體識別腫瘤細胞表面抗原， 從而得到腫瘤治療靶標。 在治療時不僅希望藥物能快速清除， 也希望能延長血清半衰期以增加抗體與靶點的作用時間， 減少用藥劑量。一些方法能增加抗體的半衰期， 如聚乙二醇化（PEGylation）， 與白蛋白結合或融合， 與抗體的Fc融合。新生受體FcRn能調節IgG和白蛋白的半衰期。這些方法也將能用于增加納米抗體的血清半衰期。

5 結語 納米抗體從發現至今， 已經發展為有廣泛生物應用價值和臨床應用價值的高度通用分子。納米抗體有來源于成年駱駝體內HCAbs的最小的功能性抗原結合片段， 具有高度穩定性和與抗原結合的高親合力， 能與蛋白裂隙和酶活性位點的相互作用， 使之作用類似于抑制劑。因此， 納米抗體可以為從肽模擬藥物設計小分子酶抑制物提供新的思路。由于僅有重鏈， 納米抗體的制造較mAb容易。納米抗體的獨特性質， 如處于極端溫度和pH環境中的穩定性， 可以低成本制造大產量。因此， 納米抗體在疾病的治療和診斷中具有很大的價值， 在腫瘤的抗體靶向診斷和治療中也具有很大的發展前景。