【摘要】 目的 探討敵敵畏(DDVP)納米乳劑和乳油的施藥周期對德國小蠊抗性相關酶活性的影響。方法 紫外分光光度法測定德國小蠊相關酶活性，采用輪廓分析研究納米乳劑、乳油的施藥周期與酶活性的關系。結果 施藥前后DDVP納米乳劑組、乳油組對德國小蠊酶乙酰膽堿酯酶(AchE)、1-NA和酸性磷酸酯酶(ApE)活性影響不同，平行性檢驗顯示可以認為兩殺蟲劑對各酶的輪廓分析不同，F值分別為159.76、317.22和2555.50(P值均小于0.05)。結論 DDVP納米乳劑、乳油施藥后對德國小蠊AchE、1-NA和ApE活性的影響趨勢不同。

【關鍵詞】 敵敵畏 納米乳劑 普通乳油 施藥周期 德國小蠊 抗性相關酶

目前已知道敵敵畏(DDVP)納米乳劑與乳油的施藥量對德國小蠊(German Cockroaches)乙酰膽堿酯酶(AchE)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)和堿性磷酸酯酶(ApE)活性的影響不同。德國小蠊酶活性改變不但與殺蟲劑的種類和施藥濃度有關，還與殺蟲劑施藥周期長短有關［1-2］。因此，有必要對敵敵畏納米乳劑與乳油的施藥周期對德國小蠊相關酶活性的影響做一對比性研究，以便了解敵敵畏納米乳劑殺滅德國小蠊的作用機理與乳油是否相同，進一步探討敵敵畏納米乳劑的毒性作用。本實驗旨在通過微量點滴法，觀察敵敵畏納米乳劑、乳油的施藥周期對德國小蠊相關酶活性的影響，進一步探索敵敵畏納米乳劑對德國小蠊的毒作用機理。

1 材料與方法

1.1 試劑 TritonX-100：上海化學試劑廠產品；碘化硫代乙酰膽堿、5，5′-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)：Sigma公司產品；a-乙酸萘酯(1-NA)、1-萘酚：上海試劑一廠產品；對硝基苯磷酸二鈉、固藍B鹽、考馬斯亮藍：Fluka公司產品；80%敵敵畏原油：南京電化廠產品；DDVP納米乳劑：本試驗室自行研制，乳液呈淺黃色，透明、均勻、不分層，乳油粒徑約為(11.2±1.9)nm，稀釋10000倍后其粒徑范圍為76～103nm。原液理化性質穩定，(-20±2)℃和(52±2)℃下儲藏14d，室溫下放置2個月均未發生渾濁，稀釋液使用時現配；其它試劑均為國產分析純或化學純。

1.2 供試蟲源及施藥方法 德國小蠊由江蘇省疾病預防控制中心昆蟲飼養室提供。選用羽化后的健康成年雄蟲，采用微量點滴法施藥(死亡率為0或低于5%)。以微量點滴器將1μL(0.0001%)量點滴在試蟲胸腹背板上，點滴后將試蟲放入潔凈果醬瓶中，正常飼養。用不施加任何藥物的德國小蠊作對照，不同施藥濃度的德國小蠊作為實驗組。

1.3 酶活性的測定

1.3.1 酶源制備 (1)AchE酶源制備：將待勻漿的德國小蠊用流動的蒸餾水沖洗，在濾紙上吸干后，取頭部，加1/15mol/L(pH8.0)含有0.5%的TritonX-100的磷酸鹽緩沖液冰浴勻漿，然后再以4000r/min離心15min，取上清液作酶源。 (2)1-NA酶源的制備：待勻漿德國小蠊用流動蒸餾水沖洗，以濾紙吸干，4℃下解剖，去消化道中食物，取中腸制備酶源。于磷酸鹽緩沖液(pH7.0，0.04mol/L)中冰浴勻漿，在3000r/min離心10min后，取上清液作酶源。 (3)ApE酶源制備：取中腸，pH4.6醋酸緩沖液(0.1mol/L)中冰浴勻漿，8000r/min離心15min后，取上清液做酶源。

1.3.2 酶活性的測定 (1)AchE活性的測定：按Groun改進的Ellman方法［3］，反應體系終體積0.2mL，10μL的1/15mol/L pH8.0的磷酸鹽緩沖液，50μL的0.75mmol/L底物(碘化硫代乙酰膽堿)，50μL酶源(調整蛋白含量在40～80μg/mL)，30℃反應15min，加入1.8mL DTNB-磷酸鹽-乙醇試劑，412nm波長下進行比色測定。 (2)1-NA酶活性測定：參照Michael和楊儉美報道的方法［4-5］，3.6mL 1-乙酸萘酯(3×104mol/L)加100μL酶液后，加0.9mL磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，30℃反應15min后，加1mL DBLS試劑(1%固藍B鹽水溶液與5%十二烷基硫酸鈉水溶液，使用前以2∶5混合)，15min后在波長600nm處測定光密度，用1-萘酚制備標準曲線，定量反應產物的量。 (3)ApE活性測定：以對硝基苯磷酸二鈉作為底物，配制成0.75×10-2mol/L水溶液。測定酸性磷酸酯酶活性的反應混合物為：2.3mL pH4.6醋酸緩沖液(0.1mmol/L)、0.5mL底物和200μL酶液。在37℃保溫30min后，用2mL NaOH(0.1mol/L)終止反應，400nm處用熱滅活后酶液作對照測定OD值，對硝基酚制備標準曲線［6］。

1.3.3 蛋白濃度的測定 按Bradford方法［7］，取0.1mL酶液，加入5mL考馬斯亮藍，595nm處測OD值，在標準曲線上查得其對應的蛋白濃度。

1.3.4 數據處理 用SAS 9.0軟件進行重復測量資料的輪廓分析。

2 結果

2.1 兩種DDVP乳液對德國小蠊AchE的影響對比(表1)

表1 DDVP納米乳劑和乳油的施藥周期對德國小蠊AchE活性的影響（略）

隨著施藥周期延長，DDVP納米乳劑組的AchE活性隨施藥時間延長呈波動性抑制趨勢，至施藥后第18天AchE活性仍表現為降低趨勢；而乳油組的AchE活性在第3天時受到最大抑制，而后酶活性開始逐漸恢復。采用SAS 9.0軟件按施藥類型分組作重復測量資料的輪廓分析，對處理因素主效應(施藥)進行分析結果可推斷：可以認為兩殺蟲劑施藥前后德國小蠊AchE活性不同(F=193.13，P＜0.05)；平行性檢驗顯示可以認為兩組輪廓不平行，即兩殺蟲劑對德國小蠊AchE的影響趨勢不同(F=159.76，P＜0.05)。

2.2 兩種DDVP乳液對德國小蠊1-NA的影響對比(表2)

表2 不同施藥周期DDVP納米乳劑和乳油對德國小蠊1-NA酶活性的影響（略）

隨著施藥周期延長德國小蠊1-NA酯酶在DDVP納米乳劑的作用下先呈波動性改變，至施藥第8天以后1-NA酶活性開始抑制，直至施藥后第18天酶活性仍低于對照組。乳油組的1-NA酯酶活性在殺蟲劑作用下未出現抑制，施藥后第8天受誘導的酶活性開始恢復，但至第18天仍然高于對照組。 采用SAS 9.0軟件按施藥類型分組輪廓分析，從處理因素主效應(施藥)分析結果可推斷：可以認為兩殺蟲劑施藥前后德國小蠊酶1-NA酶活性不同(F=271.47，P＜0.05)；平行性檢驗顯示可以認為兩組輪廓不平行，即兩種殺蟲劑對德國小蠊1-NA酶的影響趨勢不同(F=317.22，P＜0.05)。

2.3 兩種DDVP乳液對德國小蠊ApE的影響對比(表3) 施藥后第1天ApE的活性在DDVP納米乳劑的作用下被激活，酶活性迅速升高，而后酶活性降低，直至施藥后第18天酶活性逐漸抑制；DDVP乳油組的ApE施藥后第1天出現降低，而后酶活性呈現強烈誘導，至第18天時酶活性仍然未恢復到原來水平。 按施藥類型分組作輪廓分析，對處理因素主效應(施藥)分析：可以認為兩殺蟲劑施藥前后德國小蠊ApE活性不同(F=2242.80，P＜0.05)；平行性檢驗顯示可以認為兩組輪廓不同，即兩種殺蟲劑對德國小蠊ApE的影響趨勢不同(F=2555.50，P＜0.05)。

表3 不同施藥周期DDVP納米乳劑和乳油對德國小蠊ApE活性的影響（略）

3 討論 AchE是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑靶標酶，AchE的改變會導致昆蟲對有機磷和氨基甲酸酯類的敏感性降低，使該酶不受抑制從而產生抗性［8-10］。以往的研究已知DDVP納米乳劑、乳油的施藥量與AchE的抑制率呈正相關，且納米乳劑對AchE的抑制作用比乳油要高。在本次研究中，隨施藥時間的延長DDVP納米乳劑對德國小蠊AchE呈波動性的抑制作用，其作用方式完全不同于普通乳油。DDVP納米乳劑對酶活性的這種波動性抑制作用，可能與納米乳劑將活性物質(DDVP油相)包裹在內核，導致藥物緩釋有關。 1-NA酶和ApE是DDVP的重要代謝酶，德國小蠊對DDVP抗藥性的產生與這兩種酶活性的增高密切相關［2］。本次實驗中DDVP納米乳劑組施藥后1-NA酶活性呈波動性升高，特別是施藥后第13天，納米乳劑施藥組的德國小蠊1-NA酶活性受到嚴重抑制，酶活性顯著低于對照組，而乳油組的酶活性無明顯降低，仍然高于對照組。ApE的活性在施藥第1天迅速升高，而后卻逐漸被抑制，直至施藥后第18天酶活性比對照組還低，說明DDVP納米乳劑能夠有效抑制ApE活性，而乳油施藥后ApE呈現強烈誘導，酶活性不斷上升，雖然第13天后有所下降，但仍高于對照組。表明DDVP納米乳劑對德國小蠊1-NA、ApE的抑制作用更強。 綜上所述，DDVP納米乳劑對德國小蠊的毒性作用與乳油完全不同，但德國小蠊對DDVP納米乳劑的抗性產生速度是否比普通乳油要慢還需進一步證實。