【摘要】 目的: 制備無明顯毒性、 高效的惡性腫瘤基因工程納米疫苗。方法: 純化融合蛋白MH， 薄膜分散－超聲法制備包裹MH的納米脂質體腫瘤疫苗NL（MH）， 并評價其粒徑、 包裹率及穩定性; 觀察NL（MH）免疫組小鼠的急性毒性反應， 及重要臟器的病理學改變。結果: 成功制備出粒徑為（80±250） nm的納米脂質體， 其藥物包裹率為30%， 于4℃放置6個月后或3 000 r/min 10 min離心后無分層， 證明其穩定性良好; 與PBS對照組相比， 免疫組小鼠未見明顯毒性反應。結論: 該惡性腫瘤基因工程納米疫苗具有良好的理化性質， 未見毒性反應。

【關鍵詞】 腫瘤特異性抗原 脂質體 樹突狀細胞 腫瘤疫苗

腫瘤疫苗能誘導特異性的抗腫瘤免疫反應， 在腫瘤防治上已經顯示出一定的效果， 被認為是最具前景的腫瘤治療方法。本實驗室運用MAGE3/Hsp70的融合蛋白免疫小鼠， 結果顯示融合蛋白誘導機體產生高效的MAGE3特異性CTL， 對表達MAGE3的B16細胞有很好的殺傷效果［1］ 。為了使該融合蛋白能更好地被機體攝取且更好地靶向腫瘤組織， 更有效地激活機體產生針對MAGE3的特異性CTL， 對表達MAGE3的腫瘤細胞具有更強的殺傷作用， 本部分實驗中采用納米脂質體為載體， 包裹MAGE3/Hsp70的融合蛋白（MH）制備惡性腫瘤基因工程納米疫苗。

1 材料和方法

1.1 材料

分光光度計（UV3000型）為日本島津公司產品; 透射電子顯微鏡（JEM2000 EX型）為日立公司產品;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF101B型）為鞏義市予華儀器有限責任公司產品; 20 kHz/500 watt超聲粉碎儀為美國ColeParmer公司產品; RPMIl640培養基購自 美國Gibco公司; 蛋黃卵磷脂和膽固醇為德國Merck公司產品; 其他試劑均為進口超純級或國產分析純級; pET28α（+）MAGE3/Hsp70質粒由本實驗室研制。

1.2 方法

1.2.1 MAGE3/Hsp70融合蛋白的純化與鑒定 MAGE3/Hsp70融合蛋白的純化見文獻［1］。采用Western blot法對MAGE3/Hsp70融合蛋白進行鑒定， 即取10 μg MAGE3/Hsp70的融合蛋白， 采用20 μL 20 mol/L PBS重懸細胞， 加入20 μL 2×Loading Buffer， 進行SDSPAGE。采用80 V， 60 min轉移PVDF膜， 50 g/L脫脂乳TTBS室溫下封閉PVDF膜60 min， 用TTBS 1∶500稀釋MAGE3抗血清， 從封閉液中取出膜， 放入抗血 清中， 37℃ 60 min。TTBS洗膜3次每次10 min， 采用TTBS緩沖液1∶5 000稀釋HRP標記的生物素化二抗， 37℃ 60 min， TTBS洗膜， DAB顯色。

1.2.2 納米脂質體的制備及工藝優化

采用薄膜分散超聲法制備納米疫苗， 選用4因素、 3水平正交設計進行工藝優化見表1（4個因素分別為大豆卵磷脂和膽固醇摩爾比（A）、 脂和水體積比（B）、 超聲時間（C）、 PBS的pH值（D）， 以包封率為考察指標來篩選處方）。脂質體具體制備步驟如下：秤取處方量的大豆卵磷脂和膽固醇于100 mL燒瓶中， 加入氯仿1～2 mL， 置于65～70℃ 水浴中， 于旋轉蒸發儀上旋轉， 減壓除去氯仿， 得到磷脂膜。另取溶有目的蛋白（1 g/L）的PBS（ pH=7.5±0.5）20 mL 于小燒杯中， 同置于65～70℃ 水浴中， 保溫待用。取預熱的PBS， 加至含有磷脂膜的燒瓶中， 65～70℃水浴中攪拌水化10～20 min， 即成脂質體液。取出該液于燒杯中， 置于磁力攪拌器上， 室溫下攪拌30～60 min。冰水浴條件下超聲10～20 min， 即得脂質體膠體液。0.1 μm聚碳酸樹脂纖維過濾3次， 整粒， 得粒徑較均勻的脂質體。用0.22 μm的濾膜過濾除菌后， 于4℃保存。表1 各個因素不同配比的正交設計（略）

1.2.3 NL（MH）的性質鑒定

(1)形態觀察: 將制成的NL（MH）500倍稀釋于生理鹽水中， 取100 μL滴于400目銅網上， 1 min后吸去上清， 10 g/L磷鎢酸負染色1 min， 自然晾干后在透射電子顯微鏡下觀察其形態。將采集的圖象經計算機圖象分析， 求得NL（MH）的平均粒徑。(2)包裹率及穩定性測定: 采用SephedexG100凝膠層析法， 洗脫液為PBS， 流速為0.5 mL/min。取NL（MH）1.0 mL上柱， 收集游離峰即為游離 的MH。同時制備不同濃度的MH標準蛋白樣品， Bradford法測定蛋白的含量， 計算出NL（MH）中游離MH的含量。將制備的NL（MH）置于4℃冰箱保存6個月后或3 000 r/min 10 min離心后， 電鏡觀察納米脂質體形態， 明確其穩定性。包封率=（系統中的總藥量 液體介質中未包封的藥量）/系統中的總藥量×100%。(3)納米疫苗急性毒性: 實驗取二級條件C57BL/6小鼠20只， 雌雄不拘， 隨機分為2組， 每組10只。PBS對照組：腹腔注射PBS 1.0 mL/鼠; 納米疫苗（NL（MH）組）: 腹腔注射包封MH的最大濃度0.3 g/L的納米疫苗， 1.0 mL/鼠， 觀察實驗鼠有無急性中毒表現， 并記錄兩周內死亡小鼠的只數。實驗結束時處死動物、剖檢（肉眼觀察主要臟器的大小、 硬度、 有無胸腹腔積液等）、 取心臟、 肝臟、 脾臟、 肺臟、 腎臟， 用4 g/L的甲醛固定， 石蠟包埋， HE染色， 行病理組織學觀察。

1.2.4 統計學處理

應用SPSS11.5統計軟件進行數據分析， P<0.05表示有統計學意義， 計量數據結果均以x±s表示。組間差異性比較采用oneway ANOVA。

2 結果

2.1 MAGE3/Hsp70融合蛋白的純化與鑒定 含有pET28α（+）MAGE3/Hsp70質粒的BL21(DE3)， IPTG誘導后進行SPSPAGE， 表達相對分子質量(Mr)為8 700的蛋白。經NiNTA Resin分離純化系統分離純化后得到純度約為90%的蛋白（圖1）; Western blot檢測于Mr約8 700出現特異性條帶（圖2）， 證明是MAGE3/Hsp70的融合蛋白。

2.2 工藝優化結果

各因素的影響規律為C>B>A>D， 最佳工藝條件為A2、 B2、 C2、 D2 。按優化配方一次批量制備出納米疫苗以供后續實驗使用。

2.3 NL（MH）的形態與粒徑

按優化工藝制備出的NL（MH）為帶乳光的半透明均質膠體。透射電子顯微鏡下觀察發現納米脂質體呈近似球形， 大小較均勻（圖3）。將采集的圖象經計算機圖象分析， 求得NL（MH）的平均粒徑為80±25 nm。

2.4 納米脂質體的包裹率及穩定性實驗

經計算， NL（MH）的包裹率為30%。于4℃放置6個月或3 000 r/min 10 min離心后， 外觀依然為 均質膠體混懸液， 無分層和沉淀現象。電鏡觀察顆粒大小無變化。

2.5 急性毒性的觀察

對照組和實驗組小鼠給藥后均無呼吸急促、 搖擺、 發抖、 弓背、 半癱、 身體僵直等急性中毒癥狀， 兩周內無實驗鼠死亡。剖殺動物后， 經肉眼觀察， 對照組組織和器官未見明顯異常， 實驗組除小鼠脾臟相對增大外， 其他器官未見明顯異常。病理學檢查各重要臟器亦無明顯異常變化如圖4。納米疫苗測不出半數致死量（LD50）， 最大耐受量在15 mg/kg 以上。

3 討論

NL（MH）具有納米級粒徑， 常規脂質體入血后， 血液中的調理素（補體、免疫球蛋白等）易吸附在它表面促使單核細胞吞噬并清除［2］。納米載藥系統可望克服蛋白/肽疫苗諸多的限制因素而成為肽類/蛋白質和DNA藥物載體的一個研究熱點［3］。不僅如此， 納米脂質體還具有緩釋的作用， Fundaro等研究了攜帶阿霉素的納米脂質體在大鼠體內的藥代動力學， 研究發現， 給藥后24 h血液內仍有阿霉素， 而常規給藥法則難以檢測到［4］。我們實驗制備的納米脂質體呈球形， 粒徑為(80±25) nm， 且大小較均勻， 首先從粒徑上保證了其具有納米藥物載體的特性。NL（MH）具有無明顯毒性特點：初步毒性實驗結果表明: NL（MH）免疫小鼠10只全部健康存活， 對小鼠的一般情況無不良影響。納米疫苗測不出半數致死量（LD50）， 最大耐受量在15 mg/kg （以脂質體包裹的MAGE3/Hsp70融合蛋白的量計算）以上。剖檢后NL（MH）組除脾臟變大， 其他臟器系數以及重要器官病理檢查結果與PBS對照組之間均無明顯差異。提示本疫苗無明顯的毒副作用， 并且能夠明顯增大免疫器官指數。免疫器官指數的增加可增強荷瘤小鼠的免疫功能， 調動機體的防御系統起到遏制腫瘤生長和轉移的作用， 這是細胞毒類藥物所不具備的優點。我們實驗制備NL（MH）選用的載體材料為大豆卵磷脂和膽固醇， 這些原料無毒， 生物相容性好， 可以通過體內代謝途徑分解， 保證了制備的納米藥物載體具有無明顯毒性的性質。NL（MH）具有良好的穩定性， 實驗制備的納米脂質體在4℃條件下儲存6個月或3 000 r/min離心10 min后， 外觀形態及理化指標都無明顯改變。這一特性使納米脂質體便于運輸和保存， 將有利促進脂質體走向臨床運用。 實驗中制備的納米脂質體的包裹率和文獻報道的相差不大［5， 6］， 后續實驗也證明該疫苗具有很好的療效， 但是距理想藥物載體還有一段距離。因為蛋白、 多肽和DNA分子質量大， 不容易得到高濃度溶液， 在脂質體制備過程中， 所以不易得到高包封率。還需深入研究， 采取一定方法進一步提高蛋白藥物的包裹率， 如改良制備工藝， 或者交聯基團增加融合蛋白的脂溶性。