作者：胡亮，周家華，余澤前，陶可濤

【摘要】 目的： 通過胰腺癌外周血微轉移模型，探討納米免疫磁珠聯合RTnestPCR檢測微轉移的敏感度及特異性。方法： 將胰腺癌細胞PANC1稀釋分別加入到正常人外周血單核細胞中，再按比例加入Fcλ非特異性受體阻斷劑以及上皮細胞EPCAM抗體，4 ℃下混勻孵育30 min，經分選柱陽性分選后提取RNA，RTnestPCR法檢測腫瘤基因人端粒酶亞單位(hTERT)和癌胚抗原(CEA)。結果： 聯合納米免疫磁珠和RTnestPCR，平均1×107外周血單核細胞可以檢測到1個腫瘤細胞。10例良性疾病對照組均未見表達。結論： 免疫磁珠聯合RTnestPCR是敏感度及特異性都較高的檢測微轉移的方法，可顯著提高腫瘤微轉移的早期檢測率。

【關鍵詞】 胰腺癌; 微轉移; 免疫磁珠; 逆轉錄巢式聚合酶鏈反應

胰腺癌的發病率有逐年升高的趨勢，90%的患者在診斷后1年內死亡。5年生存率僅為1%～3%。雖然切除原發腫瘤和術后放化療可以延長腫瘤患者的生存率，但是5年生存率仍較低，在4%左右，即使患者行根治性手術切除，80%的患者在2年內出現復發[1]。研究發現，這與微轉移有關[2]。

檢測腫瘤微轉移的標本有淋巴結、外周血、骨髓、門靜脈血、腹腔沖洗液、腹膜、胸腔沖洗液、胰液、糞便等。外周血具有可以重復抽取、患者更樂于接受、創傷小的優點，所以臨床上可以用來檢測微轉移，以此監測患者輔助治療的效果[3]。

本實驗模擬胰腺癌外周血微轉移，利用納米免疫磁珠分離外周血腫瘤細胞，再應用RTnestPCR法檢測人端粒酶亞單位(hTERT)、癌胚抗原(CEA)兩種腫瘤標志物確定外周循環微轉移存在，探討納米免疫磁珠聯合RTnestPCR法檢測微轉移的敏感度及特異性。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

上皮細胞特異性的抗人EPCAM 納米免疫磁珠(50 nm)(德國Miltenyi公司生產)，Fcλ非特異性受體阻斷劑(德國Miltenyi公司生產)，Mini磁場(德國Miltenyi公司生產)，分選柱(德國Miltenyi公司生產)。淋巴細胞分離液(天津中國科學院生產)，RTPCR試劑盒(日本Toyobo公司生產)，RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司生產)。引物設計軟件Primer Premier 5.0。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 體外培養胰腺癌細胞PANC1

取對數生長期的PANC1消化并捶打成單個細胞，離心后分散懸浮于PBS中，制成細胞懸液。

1.3 單核細胞分離

將健康人第1管外周血約5 ml棄去(防止上皮細胞污染)，取第2管外周靜脈血10 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后用淋巴細胞分離液獲取外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。

1.4 參照模型的建立

人胰腺癌細胞PANC1用磷酸鹽緩沖液稀釋，然后加入至健康人單核細胞中，使腫瘤細胞與PBMC比例平均分別為104∶1×107、103∶1×107、102∶1×107、101∶1×107、100∶1×107、100∶2×107 。

1.5 良性疾病對照組

共10例良性疾病患者，其中6例為膽囊結石，3例膽管結石，1例為脾異位。

1.6 免疫磁珠分離

上述獲得的PBMC，按照每5×107單核細胞比例加入Fcλ非特異性受體阻斷劑100 μl，4 ℃下混勻30 min;按相同比例加入上皮細胞特異性的抗人EPCAM 免疫磁珠 ， 4 ℃下混勻30 min。加入1 ml BSA洗滌2次去除多余抗體。200 μl BSA重新懸浮。將分選柱放入磁場，先用500 μl BSA濕潤柱子，然后將200 μl細胞懸浮液加入柱子，每次使用500 μl BSA沖洗柱子，沖洗3次，將分選柱移出磁場，加入1 ml BSA，加壓沖洗柱子，得到分選出的腫瘤細胞，800 r·min-1離心。

1.7 RTnestPCR

1.7.1 RNA提取及cDNA合成 加入1 ml Trizol，放置5 min，加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，將上層無色水相移到新離心管中，加入等體積異丙醇，混勻室溫放置30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，去上清，加入1 ml 75%乙醇洗滌。4 ℃ 5 000 r·min-1離心3 min倒出液體，室溫放置晾干，加入適量RNasefree雙蒸水吹打混勻。按照RTPCR試劑盒要求合成cDNA，放置-20 ℃備用。

1.7.2 nestPCR CEA的引物序列:外引物5′TCTG

GAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG3′(正義鏈)，5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′(反義鏈)，擴增產物大小為160 bp;內引物5′TGTAGCTG

TTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′(正義鏈)，5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG3′(反義鏈)，產物大小為131 bp。HTERT的引物序列為：外引物5′TGGTGGATGATTTCTTGTTGG3′(正義鏈)，5′GCAGG

AGGATCTTGTAGATGTTG3′(反義鏈)，產物大小423 bp;內引物5′CCCTGAATGAGGCCAGCAGT3′(正義鏈)，5′CTCCATGTCGCCGTAGCACA3′(反義鏈)，產物大小161 bp。第1輪擴增: 95 ℃預變性5 min;然后95 ℃變性45 s，50 ℃(hTERT)/55 ℃(CEA)退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環;最后72 ℃延伸5 min。第2輪擴增:95 ℃預變性5 min;然后95 ℃變性45 s，57 ℃(hTERT)/53 ℃(CEA)退火45s，72 ℃延伸45 s，35個循環;最后72 ℃延伸5 min。以上步驟重復2次。

1.8 PCR產物凝膠電泳

上述所得PCR產物均以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用100 bp梯度 DNA ladder作為相對分子質量標志。

2 結 果

在6組腫瘤細胞與PBMC不同比例組(104∶1×107、103∶1×107、102∶1×107、101∶1×107、100∶1×107、100∶2×107)中，在1～5組均檢測到CEA、hTERT表達(圖1)。敏感度可以達到平均1×107外周血單核細胞可以檢測到1個腫瘤細胞。10例良性疾病對照組中均無表達。

3 討 論

微轉移的檢測方法主要有免疫組化染色、流式細胞技術、聚合酶鏈反應、逆轉錄聚合酶鏈式反應、實時定量RTPCR技術、利用上皮腫瘤細胞大小分離技術等[4]， 這些方法各具優缺點，目前應用最廣泛的是免疫組化染色和分子生物學方法。免疫組化方法雖然可以直觀地檢測到微轉移的存在與否，但需要選擇應用特異性及敏感度較高抗體等原因，導致敏感度低于分子生物學方法。分子生物學方法具有較高的敏感度，也正是因為其具有較高敏感度，導致了假陽性產生[5]。所以，目前研究的主要重點在于找到一種能夠具有較高靈敏度及特異性的微轉移檢測方法。

腫瘤患者外周血循環中腫瘤細胞數量與腫瘤分期之間存在一定關系，腫瘤分期越高，其循環中腫瘤細胞數量越多[56]。所以在檢測腫瘤患者外周血循環中腫瘤細胞存在與否時，檢測的靈敏度尤為重要。對于外周循環中播散的腫瘤細胞較少的腫瘤患者，如果采用靈敏度較高的檢測方法，就可以早期檢測到微轉移的存在。

應用納米免疫磁珠聯合RTnestPCR法，既保證了檢測的特異性，又提高檢測的靈敏度。免疫磁珠表面附著有上皮細胞免疫分子(EPCAM)抗體，此種抗體可識別34 000、39 000兩種糖蛋白，它們表達于大多數正常和瘤組織上皮細胞的膜表面。包被有抗體的磁珠與上皮細胞表面的抗原進行免疫化學結合，隨后運用磁場將這些細胞從樣品中分離出來。這樣既保證了分離得到的腫瘤細胞的純度，又減少了血細胞的污染，從而提高了微轉移檢測的特異性。

nestPCR的優點在于，如果第1次擴增產生了錯誤片斷，則第2次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低[7]。因此，nestPCR的擴增特異性非常高。而且由于對第1次PCR的產物進行了第2次PCR擴增，所以敏感度較高。本實驗最初應用免疫磁珠普通的PCR方法檢測率較低，僅達到104個單核細胞中檢測到1個腫瘤細胞。考慮以下原因：(1)免疫磁珠的高特異性導致富集到的腫瘤細胞數量較少，腫瘤細胞純度較高導致提取總RNA量較少，PCR產物量從而較少。(2)另外引物設計方面也有一定關系。

本實驗中10名良性疾病患者均未表達hTERT及CEA 2個腫瘤指標表達，且胰腺癌細胞株PANC1均表達這2個腫瘤指標，所以檢測到標本表達CEA及hTERT，意味著檢測到了有活力的腫瘤細胞，就可以確定微轉移的存在[8]。免疫組化方法檢測外周血微轉移的敏感度可以達到在105～106個單核細胞中可以檢測到1個腫瘤細胞[9]。而免疫磁珠聯合RTPCR方法檢測微轉移的敏感度可以達到在107個單核細胞中檢測到1個腫瘤細胞，可見其敏感度明顯高于免疫組化法。 腫瘤細胞存在異質性，所以聯合檢測多個腫瘤基因，可以提高微轉移檢測的特異性及敏感度，提高檢測陽性率，降低檢測的假陰性率。本實驗對比單獨應用RTPCR法及免疫磁珠聯合RTPCR法檢測外周循環腫瘤細胞播散模型的敏感度，發現單獨運用RTPCR法敏感度只能夠達到1個腫瘤細胞/1×106 個PBMC，但應用免疫磁珠聯合RTPCR法敏感度達到1個腫瘤細胞/1×107PBMC 。