【摘要】 目的： 通過制備As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒來研究熱化療對乳腺癌的治療效果。方法： 采用改良的化學沉淀浸漬法制備As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒，通過透射電鏡、掃描電鏡、能譜儀、原子熒光光譜儀來表征;檢測As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒的釋藥水平及在交變磁場中的升溫能力;通過MTT比色法和流式細胞儀檢測化療組、熱療組及熱化療組乳腺癌的治療效果。結(jié)果： 制備的復合納米粒粒徑為20～40nm;復合納米粒體外升溫能達到腫瘤的有效治療溫度(41～46 ℃);釋藥緩慢，48 h釋藥為14.67%。結(jié)論： 采用改良的化學沉淀浸漬法可以成功制備As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒，體外實驗證明該復合納米粒聯(lián)合交變磁場熱療對乳腺癌細胞具有很強的生長抑制和凋亡誘導作用。

【關(guān)鍵詞】 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4; 納米; 熱化療; 乳腺癌

惡性腫瘤的診斷和治療一直是醫(yī)學領(lǐng)域試圖攻克的難題，隨著醫(yī)學水平的發(fā)展，人們對腫瘤治療新型方法的研究已經(jīng)向分子和原子水平邁進。1996年，德國學者Jordan等[1] 發(fā)現(xiàn)納米級磁微粒比微米級微粒能產(chǎn)生更多的熱量，提出了磁流體熱療(magnetic fluid hyperthermia， MFH)新技術(shù)。本實驗采用改良的化學沉淀浸漬法制備了As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒，將具有廣譜抗癌性的As2O3和磁流體(錳鋅鐵氧體)熱療結(jié)合起來，對乳腺癌MDAMB231細胞株進行熱化療的體外實驗研究。

1 試劑和儀器

As2O3、二甲基亞砜(DMSO， Sigma公司);HEPES、胰酶、噻唑藍(Amresco);硫酸錳、硫酸鋅和硫酸亞鐵等均為分析純;DMEM(Gibco Brl， 美國);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);能譜儀(Noran， Vantage，美國);H600透射電鏡(Hitachi，日本);掃描電鏡(JEOLJSM6360LV，日本);酶標儀(美國BD公司);流式細胞儀(FACS Vantage SE， BectonDickson，美國);原子熒光光譜儀(北京瑞利分析儀器公司); MDAMB231(購自中國科學院上海細胞研究所)。

2 方 法

2.1 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒的制備

采用改良的化學沉淀-浸漬法制備復合納米粒，按Mn2+、Zn2+、Fe2+摩爾比1∶1∶4準確稱量適量MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O和FeSO4·7H2O33種硫酸鹽，研成粉末后將適量NaOH溶液加入其中，磁力攪拌器高速攪拌3 h后放入80 ℃烤箱干燥，馬弗爐400 ℃焙燒1 h，自然冷卻后用熱蒸餾水浸洗去除可溶性硫酸鈉無機鹽，烘干成錳鋅鐵氧體粉末，配制亞砷酸溶液使As2O3濃度為0.01 mg·ml-1、0.02 mg·ml-1、0.03 mg·ml-1、0.04 mg·ml-1，稱取適量錳鋅鐵氧體粉末浸漬于其中，離心烤干。

2.2 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒的表征

2.2.1 形態(tài)觀察 取出少量制備的As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒，加入無水乙醇超聲分散20min后滴銅網(wǎng)，在透射電鏡下觀察形態(tài)，取少量粉末在掃描電鏡下觀察。

2.2.2 能譜儀測定復合納米粒的成分 掃描電鏡下對制備的復合納米粒成分進行能譜分析，確定其元素組成成分。

2.2.3 磁響應(yīng)性檢測 用適量生理鹽水將復合納米粒配成混懸液，在燒杯下放置一磁鐵觀察磁性材料聚集情況。

2.2.4 含砷量測定 用原子熒光光譜儀測定其含砷量。

2.3 升溫試驗

將復合納米粒用生理鹽水配成6、8、10、12 g·L-1的磁流體，置于頻率為200 kHz、輸出電流300 A的交變磁場下進行升溫試驗，每5 min記錄1次溫度。

2.4 釋藥試驗

用生理鹽水配成10 g·L-1的混懸液，取10 ml裝于透析袋中，外面透析介質(zhì)亦為生理鹽水，磁力攪拌器常溫攪拌5 0 h，每隔1 h取液測量釋放液中As含量，繪制累積釋藥曲線。

2.5 細胞株和細胞培養(yǎng)

乳腺癌細胞株MDAMB231常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

2.6 MTT比色法檢測細胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期MDAMB231細胞，消化吹打成2.5×104 ml-1，在兩塊96孔培養(yǎng)板中每孔接種200 μl(每板兩組，每組8個復孔)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h細胞貼壁后一塊培養(yǎng)板分別加入DMEM培養(yǎng)液(陰性對照組)、5 μmol·L-1As2O3溶液培養(yǎng)(化療組)，另一塊培養(yǎng)板分別加入10 g·L-1的Mn0.5Zn0.5Fe2O4培養(yǎng)液(熱療組)及As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒培養(yǎng)液(熱化療組)，置于200 kHz、4 kW、輸出電流300 A的交變磁場加熱1 h繼續(xù)培養(yǎng)，48h后加入MTT20 μl，4 h后棄去液體，每孔加入150 μlDMSO，置于酶標儀上振蕩混勻10 min測OD493 nm值，細胞增殖抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值。

2.7 流式細胞術(shù)測凋亡率

按上述分組將治療48 h后細胞制成單細胞懸液，PBS洗滌細胞兩次，70%乙醇4 ℃固定細胞24 h以上。檢測前用PBS洗滌細胞兩次，細胞重懸于0.5 mlPI染色液(20 g·ml-1，0.25 mg·ml-1RNase A)中，室溫避光染色30 min，用300目絲網(wǎng)過濾后即可上機分析。

3 結(jié) 果

3.1 表征

采用化學沉淀-浸漬法制備的As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米材料為棕褐色粉末，在外磁場作用下具有良好的磁響應(yīng)性，能夠形成明顯的磁力線。用透射電鏡和掃描電鏡觀察，As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒近似球形，密度較高，粒徑在20～40 nm(圖1)，掃描電鏡下任選一視野進行能譜分析，均能檢測到錳、鐵、鋅、砷等材料成分(圖2)。用原子熒光分光光度計測定的As標準工作曲線為：I=3.737+13.097C，r=0.999 5，其中I為分析信號峰面積，C為As濃度，經(jīng)測定復合材料中含砷量為0.05%。

3.2 升溫情況

不同濃度的As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒在體外交變磁場作用下具有升溫能力，在前30 min升溫迅速，30～45 min升溫平緩，之后溫度基本保持恒定不變，且10 g·L-1濃度的復合納米粒升溫能達到腫瘤治療的有效溫度(41～46℃)(圖3)。

3.3 體外釋藥速率的動態(tài)測定結(jié)果

以生理鹽水為介質(zhì)考察了As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米材料的體外動態(tài)釋放，計算其累積釋放率，48 h釋藥為14.67%，曲線平緩(圖4)。

3.4 MTT比色法檢測結(jié)果

結(jié)果顯示As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒聯(lián)合交變磁場加熱組能顯著抑制細胞增殖，且比單純As2O3溶液組和Mn0.5Zn0.5Fe2O4聯(lián)合交變磁場加熱組的抑制作用明顯(表1)。表1 As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒聯(lián)合熱化療組可出現(xiàn)DNA含量明顯低于G1期的亞G1期細胞峰，即凋亡峰(凋亡率為31.18%)，顯著高于化療組(凋亡率為7.44%)和熱療組(凋亡率為16.17%)，而陰性對照組則幾乎無凋亡峰(圖5)。

4 討 論

砷及其化合物是人類最早用于治療腫瘤的藥物，目前As2O3注射液已作為國家二類新藥正式上市，國內(nèi)外研究其對實體瘤的作用，如乳腺癌[2] 、肺癌[3]、食管癌[4]、胃癌[5]，確認了其廣譜抗癌性，其機制主要是促進腫瘤細胞分化、誘導其凋亡，多途徑抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移且毒副作用小，對正常細胞無明顯影響。而腫瘤熱療是用加熱方式治療腫瘤的一種新方法，即利用物理能量在組織中沉淀而產(chǎn)生熱效應(yīng)，使腫瘤組織溫度上升到有效治療溫度(41～46 ℃)[6]以殺死癌細胞，又不損傷正常細胞的新型治療方法，熱療不僅沒有化療及放療的副作用，而且可以克服腫瘤細胞的耐藥性，大大增強癌細胞對化療和放療的敏感性[7]，誘導細胞凋亡。近年來，許多研究者將砷與熱療通過不同的形式聯(lián)合起來治療惡性腫瘤，取得了顯著的成果，如邢寶玲等[8]將As2O3和自行研制的納米錳鋅鐵氧體磁性材料一起用脂質(zhì)膜包裹起來制成As2O3磁性納米脂質(zhì)體，體外抗卵巢癌細胞實驗顯示，將As2O3與熱療聯(lián)合起來對癌細胞的毒殺作用強于單純的As2O3組和熱療組。倪海燕等[9]通過乳化冷凍凝聚法制備了As2O3磁性納米微球，并通過治療宮頸癌證明了As2O3聯(lián)合熱療對腫瘤細胞的生長抑制和誘導凋亡作用明顯。

本研究中通過制備As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒并作用于乳腺癌細胞，我們探討了將As2O3的細胞毒作用同磁熱療相結(jié)合，以期尋求一個更有效地殺傷惡性腫瘤細胞的方法。As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒是采用改良的化學沉淀-浸漬法[10]制備的，這種方法的優(yōu)點是合成工藝簡單，成本低廉，且制備的粒徑為20～40 nm，由于粒徑極小，在體內(nèi)不但可以逃脫MPS的捕獲，而且還具有很強的吸收電磁波能量而轉(zhuǎn)化為熱能的能力。將活性組分AS2O3溶液用浸漬法加到載體納米級錳鋅鐵氧體粉末上，由于作為載體的Mn0.5Zn0.5Fe2O4比表面極大，吸附性能優(yōu)良，能使被吸附的藥物與載體周圍的藥物之間始終保持著一種動態(tài)平衡，當游離的藥物被體液稀釋或被機體代謝濃度下降時，根據(jù)吸附等溫曲線的平衡曲線，制劑馬上釋放等量的藥物來補足被消耗的量，可以控制藥物的緩慢釋放，這不但提高了藥物療效，還可以使靶區(qū)以外的A. 陰性對照組 B. 化療組C. 熱療組 D. 熱化療組圖5 各實驗組流式細胞分析結(jié)果

Fig 5 The results of flow cytometry

砷濃度大大降低，從而減輕了藥物對正常組織的毒副作用。另外復合納米粒的體外升溫實驗表明，復合納米粒在交變磁場中具有良好的升溫控溫能力，不同濃度的復合納米粒在交變磁場中升溫控溫的能力有所差別，實驗結(jié)果表明濃度為10g·L-1的材料在交變磁場中能升溫至腫瘤治療的恰當溫度45 ℃且保持溫度不變，可發(fā)揮既殺死腫瘤細胞而又不損失正常細胞的作用。實驗中我們分為陰性對照組、化療組、熱療組及熱化療組，MTT比色法檢測結(jié)果顯示As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米材料聯(lián)合交變磁場熱療組對于人乳腺癌細胞具有強烈的細胞毒性，此組的細胞生存率明顯低于化療組和熱療組。流式細胞分析亦顯示， As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米材料聯(lián)合交變磁場熱療誘導的細胞凋亡率較相應(yīng)同等濃度的單純As2O3液及單純磁性材料熱療組的細胞凋亡率要高，前者為 31.18%，而后兩者分別為 7.44%、16.17%。

本實驗成功制備了直徑為20～40 nm、升溫能達到腫瘤治療有效溫度同時可控緩慢釋放藥物的As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4復合納米粒，合成工藝簡單、易行，成本低廉.通過體外細胞實驗證實，該納米粒聯(lián)合交變磁場熱療對腫瘤細胞具有很強的生長抑制和凋亡誘導作用，為治療乳腺癌提供了新的思路。