作者：吳利清，張熙之，方芳，王怡紅，張宇，顧寧

【摘要】 目的：制備穩(wěn)定的水溶性Fe3O4納米粒子(PMATFe3O4)磁共振成像(MRI)造影劑，并對合成的粒子進行表征。方法：利用高分子聚1十四碳烯馬來酸酐(PMAT)修飾油溶性Fe3O4納米粒子表面，使粒子表面富含親水性羧基基團，使粒子能夠穩(wěn)定存在于水相中，并用透射電鏡(TEM)、動態(tài)光散射(DLS)、振動樣品磁強計(VSM)、傅立葉紅外吸收光譜(FTIR)和MRI等方法進行表征。結果：(1) TEM分析顯示，PMATFe3O4粒子直徑約為10 nm，DLS測定其水動力學平均直徑約為80 nm;(2) PMATFe3O4粒子能穩(wěn)定分散于去離子水、PBS、Tris、MES等緩沖液中，不發(fā)生團聚;(3) VSM、MRI等分析手段顯示，PMATFe3O4的飽和磁化強度Ms≈14.0 emu·g-1，弛豫率r2=367.79 mM-1s-1。結論：PMATFe3O4具有良好的水溶性、磁學性能和較高的r2值，有望發(fā)展成為一種性能優(yōu)異的MRI造影劑。

【關鍵詞】 Fe3O4納米粒子; 表面修飾; 聚合物; 弛豫率

[Abstract] Objective: To synthesize stable and watersoluble PMATFe3O4 nanoparticles(NPs) as MRI contrast agent and characterize it. Methods: Poly maleic anhydride alt1tetradecene(PMAT) was utilized to modify the surface of oilsoluble NPs， and the obtained PMATFe3O4 NPs were characterized by TEM， DLS， FTIR， VSM and MRI. Results: (1) TEM and DLS studies showed that the PMATFe3O4 NPs have a magnetic core size of about 10 nm and a hydrodynamic diameter of about 80 nm.(2) PMATFe3O4 could keep stable in water and familiar buffers， such as MES， PBS and Tris without aggregation.(3) VSM measurements showed that the saturation magnetization(Ms) was about 14.0 emu·g-1， the relaxivity value(r2) of PMATFe3O4 was 367.79 mM-1s-1. Conclusion: The obtained PMATFe3O4 NPs possess outstanding watersolubility， good magnetic properties， and high r2 value， which are therefore expected to become an excellent MRI contrast agent.

[Key words] Fe3O4 nanoparticles; surface modification; polymer; relaxivity

磁性納米粒子(NPs)在生物技術和生物制藥等領域已顯示出良好的應用前景[1]。氧化鐵納米粒子由于具有獨特的磁學性質和良好的生物相容性，研究其作為造影劑在磁共振成像(MRI)技術方面的應用，已成為發(fā)展最為迅速和最為重要的課題之一。其中，化學制備具有穩(wěn)定水溶性和高弛豫率(r)的磁性氧化鐵納米粒子是一個重要的研究方向。r的大小是考察氧化鐵納米粒子是否具有良好造影能力的重要參數(shù)，它分為r1和r2兩種，分別代表了單位濃度粒子縮短體系內(nèi)質子弛豫時間T1和T2的效率[2-4]。本實驗利用高分子聚1十四碳烯馬來酸酐(poly maleic anhydride alt1tetradecene， PMAT)，對油溶性的油酸包覆的Fe3O4納米粒子(oleicFe3O4)進行表面修飾，使其能夠穩(wěn)定分散于水相中，獲得水溶性Fe3O4納米粒子(PMATFe3O4)，研究表明，該種納米粒子具有較高弛豫率r2值，能夠作為良好的MRI造影劑。

1 材料與方法

1.1 材料

PMAT(SigmaAldrich)、透析袋(50 KDa)、oleicFe3O4(參照文獻[5]報道，本實驗室制備)。

1.2 主要試劑

氯仿(上海市四赫化工有限公司)，碳酸鹽緩沖液(pH 10.8)、MES緩沖液(pH 6.0)、PBS緩沖液(pH 7.4)、Tris緩沖液(pH 8.0)(緩沖液均為本實驗室配制)，正己烷(上海市實德化學有限公司)，去離子水。

1.3 實驗方法

1.3.1 PMATFe3O4納米粒子制備

稱取0.05 g oleicFe3O4固體粉末和0.2 g PMAT，分別溶于10 ml氯仿中，超聲5 min后，室溫下于50 ml燒瓶中混合攪拌反應4 h。旋轉蒸發(fā)除去溶劑氯仿，得到黑色固體。在氮氣保護下，將黑色固體加入30 ml碳酸鹽緩沖液，50 ℃下在100 ml三頸瓶中劇烈攪拌反應3 h，得到穩(wěn)定的黑色水溶性PMATFe3O4納米粒子。

1.3.2 提純

將以上PMATFe3O4納米粒子用220 nm濾膜過濾后，置于磁場下磁分離，待分層明顯后，取下部磁性物質重新分散于10 ml去離子水中，用去離子水透析24 h，透析過程中換去離子水3次，得到純凈的分散于水中的PMATFe3O4納米粒子。

1.3.3 表征

運用多種分析手段對所制備的粒子進行表征，研究其作為造影劑的性能。

1.3.3.1 Fe濃度測定 使用鄰二氮菲分光光度法[6]對樣品的Fe濃度進行測定。制備了3個濃度梯度的樣品待測，其中Fe含量比為2 ∶1 ∶ 0，測得Fe濃度為1.7 mg·ml-1。

1.3.3.2 透射電鏡(TEM)分析 將樣品用去離子水稀釋后，滴1滴于TEM專用銅網(wǎng)上，40 ℃下真空烘干8 h，待測。儀器型號為JEM200CX。

1.3.3.3 動態(tài)光散射(DLS)分析 將樣品用去離子水稀釋至Fe濃度為0.5 mg·ml-1后，室溫下測定其水動力學粒度分布。儀器型號為Malvern ZetaSize 3000HS。

1.3.3.4 傅立葉紅外吸收光譜(FTIR)分析 取1 ml制備的PMATFe3O4溶液，以6 mol·L-1鹽酸調(diào)至等電點，析出的黑色固體用去離子水洗滌3次，40 ℃真空干燥，得到黑色固體粉末，待測。儀器型號AVATAR 360FTIR。

1.3.3.5 振動樣品磁強計(VSM)分析 制樣同F(xiàn)TIR。儀器型號為Lakeshore 7400。

1.3.3.6 MRI 準確配制Fe濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg·ml-1 PMATFe3O4溶液，各取1.4 ml液體于1.5 ml離心管中，待測。室溫下，MRI實驗磁場強度為7.0 T，自旋回波序列，脈沖重復間隔時間TR為2 500 ms，回波時間TE分別為11.0、22.0、33.0、44.0、55.0、66.0、77.0、88.0、99.0、110.0、121.0、132.0、143.0、154.0、165.0和176.0 ms。儀器型號為Bruker Pharma Scan，7.0 T，孔徑為16 cm，最大梯度強度為300 mT·m-1。

2 結 果

2.1 粒度分析

使用PMAT修飾后，PMATFe3O4可以穩(wěn)定存在于水環(huán)境中，包括MES、PBS、Tris等緩沖液體系中。在4 ℃條件下，粒子可以長時間保存不發(fā)生沉積。TEM分析顯示，PMATFe3O4分散性良好(圖1)，這主要是由于粒子間的靜電排斥作用和空間位阻作用的結果，但是小的聚集體仍然存在。PMATFe3O4納米粒子的直徑約為10 nm，與油溶性oleicFe3O4相比，粒度并無明顯改變。DLS分析顯示，在水環(huán)境中，PMATFe3O4的水動力學平均直徑約為80 nm(圖2)，明顯高于TEM測得的尺寸，這可能有兩個原因：(1) DLS統(tǒng)計的是納米粒子在水環(huán)境中的整體尺寸，包括表面有機物殼層和水化層對粒徑大小的貢獻，而修飾在粒子表面的有機物分子包裹層并不能在TEM圖中顯示出來;(2) 有幾個Fe3O4納米粒子被PMAT包裹成一個整體，形成一個相對較大的PMATFe3O4粒子，影響了粒子的整體尺寸分布。a. oleicFe3O4; b. PMATFe3O4

2.2 FTIR分析

通過對粒子紅外圖譜的分析，可以獲得粒子的化學結構信息，見圖3。a和b曲線中，2 850 cm-1和2 930 cm-1的吸收峰表明粒子中存在大量的甲基與亞甲基基團，同時，由于大量有機聚合物PMAT的存在，PMATFe3O4中FeO伸縮振動吸收峰(593 cm-1)的強度[7]并不如oleicFe3O4高;b曲線中，1 707 cm-1的吸收峰表明體系中大量羰基(C=O)的存在，這是由于大量酸酐水解產(chǎn)生羧基所導致，同時a曲線的羰基吸收峰很不明顯。PMATFe3O4納米粒子表面羧基所帶負電荷是其能夠穩(wěn)定分散于水環(huán)境中的原因之一。a. oleicFe3O4; b. PMATFe3O4

2.3 磁性分析

磁滯回線顯示，oleicFe3O4的飽和磁化強度Ms為57.0 emu·g-1，PMATFe3O4的飽和磁化強度Ms值約為14.0 emu·g-1，見圖4。a. oleicFe3O4; b. PMATFe3O4由圖4可見，修飾后Ms值下降了很多，這可能是由于受到粒子表面較厚的有機修飾物的影響，盡管如此，還是能夠滿足常用的生物應用要求，很多報道證明了這一點[8-9]。修飾前oleicFe3O4的矯頑力為0.183 Oe，修飾后只有微小改變，為0.141 Oe，很接近于0，說明Fe3O4磁核具有良好的超順磁性[10-11]，適合作MRI造影劑。超順磁性是指磁性粒子尺寸小于某一臨界尺寸時，表現(xiàn)出矯頑力為零，室溫熱即能夠克服磁各向異性使磁矩能夠任意翻轉的狀態(tài)。當存在外磁場時，超順磁性粒子能夠被迅速磁化，表現(xiàn)出較強的磁性，一旦撤去外磁場，則磁性消失，表現(xiàn)出平均磁化強度為零的狀態(tài)[12]。

r是反映磁性粒子磁學性質的重要物理量，是粒子作為造影劑的重要參數(shù)，定義為單位濃度(mmol·L-1)活性離子所導致的水溶液弛豫速度的增加。r的確定需要測量樣品在不同濃度時的弛豫時間T。T又分為T1和T2，T1為縱向弛豫時間，又稱自旋晶格弛豫時間，T2為橫向弛豫時間，又稱自旋自旋弛豫時間[13]。以測定氧化鐵納米粒子r2為例。一般地，MR信號強度(SI)可表示為：SI=S0(eTE/T2)(1eTR/T1)，式中TR為重復時間，TE為回波時間，S0是常數(shù)。當TR趨于無窮大，1eTR/T1項接近1，所以可排除T1的影響。假設TR遠大于T1，上述方程可簡化為：SI=S0(eTE/T2)，將方程兩邊取對數(shù)，得：ln(SI)=ln(K)-TE/T2，通過測量不同回波時間的MR信號強度并根據(jù)計算公式進行指數(shù)擬合，可得到不同濃度材料的T2值。PMATFe3O4在不同F(xiàn)e濃度下測得的T1和T2值見表1。表1 PMATFe3O4納米粒子弛豫時間T與Fe濃度關系

T2與T1相比，其值遠小于T1，且梯度關系明顯;經(jīng)過線性模擬計算，r1=0.34 mM-1s-1，r2=367.79 mM-1s-1，r1遠小于r2。對于氧化鐵納米粒子，r表示含有1 mmol·L-1 Fe的水溶液相對于純水的弛豫速度的增加，可表達為下式：1/T1=1/T1([Fe]=0)+r1[Fe];1/T2=1/T2([Fe]=0)+r2[Fe]。式中1/T為樣品弛豫時間的倒數(shù)，即弛豫速度;1/T([Fe]=0)為Fe濃度為0時的弛豫速度，即純水弛豫速度;[Fe]為樣品體系中Fe的濃度。以弛豫速度(1/T1，1/T2，s-1)作為[Fe](mmol·L-1)函數(shù)，繪制線性擬合圖，擬合直線的斜率即為所測粒子的r，見圖5。結果顯示，PMATFe3O4具有較高的r2，為367.79 mM-1s-1，而其r1值則十分小，約為0.34 mM-1s-1，說明其可作為良好的T2造影劑。

將PMATFe3O4納米粒子作為T2陰性造影劑所得MRI圖像，見圖6。磁場強度為7.0 T，實驗環(huán)境為室溫，TE=66.0 ms。由圖6可見，信號強度從強到弱，F(xiàn)e濃度分別為0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg·ml-1，可以看出，作為陰性造影劑，隨著Fe濃度的升高，PMATFe3O4的造影能力增強，梯度變化明顯，與其高r2值相對應。圖5 PMATFe3O4弛豫速度與樣品Fe濃度關系

3 討 論

用來修飾納米粒子的分子種類很多，常見的有無機分子，如Au[2]、Si[14]等;有機小分子，如二巰基丁二酸(DMSA)[15]等;而有機大分子由于其良好的生物相容性和來源廣泛，亦得到了廣泛的應用，常用的有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)[16]、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)[17]等。

修飾物連接于Fe3O4納米粒子表面的機理可以分為兩種基本模式，第一種是表面修飾物非共價吸附，即修飾后修飾物與納米粒子表面并不形成新的共價鍵，修飾物通過非共價鍵連接在納米粒子表面，主要作用力有范德華力、疏水作用、靜電吸附等，這種方式主要應用于一些具有較長碳鏈的有機大分子修飾，靜電力與空間位阻都對修飾后粒子的穩(wěn)定性具有積極作用;第二種是修飾物改變，即新的修飾物將納米粒子表面已有的修飾物取代，新的修飾物與納米粒子表面以共價鍵相連接，這種方式可以在粒子表面引入目標分子，也可以取得良好的效果[18-19]。

PMAT是一種兩親性聚合物，其中疏水烷基鏈可能是以疏水作用非共價吸附并包裹于oleicFe3O4表面，即采用上述的第一種模式，使納米粒子表面富含親水性官能團羧基。PMAT大分子所提供的空間位阻和羧基所帶有的負電荷(靜電作用)是PMATFe3O4粒子能夠穩(wěn)定存在于水相中的兩種主要作用力。經(jīng)過修飾后，PMATFe3O4納米粒子可以穩(wěn)定分散于水相中，包括MES、PBS、Tris等緩沖液體系，且能長時間保持穩(wěn)定，不發(fā)生團聚，同時，PMATFe3O4具有較高的r2，為367.79 mM-1s-1，提示其可作為一種潛在的MRI造影劑。作為對比，本實驗測定了相同條件下市售產(chǎn)品Feridex[20]的r2，約為221.69 mM-1s-1，遠比PMATFe3O4的r2值小。

影響磁性納米粒子r大小的因素有粒子的飽和磁化強度、晶體組成成分、晶格形式、尺寸大小和粒子優(yōu)化修飾等。已有研究報道，較大的粒子尺寸和粒子的聚集均會提高粒子r[1]。本實驗中，晶體組成成分和晶格形式都不會發(fā)生變化，但是PMATFe3O4磁核的粒徑比Feridex相對較大，且通過觀察TEM電鏡圖，可以發(fā)現(xiàn)會有2-3個粒子被聚合物包裹在一起，形成穩(wěn)定的聚集體，即增大了粒子的尺寸分布，所以，PMATFe3O4相對較高的磁性粒子尺寸分布直徑導致了其較高的r2，而高r是納米粒子具有優(yōu)良造影劑能力的重要參數(shù)。

本實驗采用PMAT修飾油溶性oleicFe3O4納米粒子，修飾后PMATFe3O4納米粒子能穩(wěn)定分散于水相中，具有較高的r2，可以作為優(yōu)良的T2陰性MRI造影劑。