【摘要】 目的： 檢測磁性納米四氧化三鐵(NanoFe3O4)聯合順鉑(DDP)作用于人源肺腺癌細胞A549后相關凋亡抑制基因、耐藥蛋白的表達，研究其增強化療敏感度的機制。方法： 用MTT法檢測NanoFe3O4聚合DDP對A549細胞增殖凋亡的影響;流式細胞術分析凋亡細胞比例;RTPCR檢測抗凋亡基因bcl2、survivin、ERCC1表達水平變化;蛋白印跡法分析耐藥蛋白MRP及其表達率。結果： 25 μg·ml-1 NanoFe3O4能有效增強DDP的細胞毒作用，提高A549的凋亡率;與單獨用藥組相比，NanoFe3O4聯合DDP組的抗凋亡基因bcl2、ERCC1和耐藥蛋白MRP表達下調，差異具有統計學意義(P<0.05);survivin基因表達未見明顯改變。結論： NanoFe3O4聯合DDP可通過下調抗凋亡基因bcl2、ERCC1及耐藥蛋白MRP的表達，增強化療藥物敏感度。

【關鍵詞】 磁性納米四氧化三鐵; 順鉑; 肺腺癌細胞系A549; 凋亡; 多藥耐藥

順鉑(DDP)是一種金屬鉑化合物，含有類似烷化劑的雙功能基團，以順鉑為主的聯合化療已成為肺癌經典治療方案[1]。但隨之出現的化療敏感度下降、腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)等問題，影響其療效，降低了患者的生存率[2]。利用納米載體聚合攜載化療藥物逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥以增強化療敏感度是一項探索性研究[3]。本實驗通過檢測磁性納米四氧化三鐵(NanoFe3O4)聯合順鉑(DDP)作用于人源肺腺癌細胞系A549后相關凋亡抑制基因及耐藥蛋白表達的動態變化，研究其增強化療敏感度的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺腺癌細胞系A549由南京軍區總醫院腫瘤中心惠贈，NanoFe3O4由東南大學生物科學與醫學工程學院提供，DDP為購自南京制藥廠的鉑龍注射液(質量濃度1 mg·ml-1)，RPMI 1640細胞培養基、胎牛血清購自Gibco公司，胰蛋白酶、MTT、DMSO試劑盒購自Sigma公司，AnnexinⅤFITC/PI試劑盒購自BD公司，bcl2、survivin、ERCC1及GAPDH基因引物由上海英駿生物科技有限公司合成，RTPCR試劑盒購自TaKaRa公司，MRP抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。酶標儀為BIORED550型，流式細胞儀為美國BD公司FACS Calibur型。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，每3～4 d傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖凋亡效應 取對數生長期細胞接種于96孔板，每孔1.2×104個細胞，孵育過夜后，選取抑制效果最明顯的25 μg·ml-1 NanoFe3O4作為藥物干預濃度。設終質量濃度為2.5、5、10、20 μg·ml-1的DDP以及上述濃度的DDP合并25 μg·ml-1的NanoFe3O4組，另設空白調零組、陰性對照組以及NanoFe3O4組，每組設3個復孔，培養24 h，用MTT法測每孔吸光度值(A490 nm)。抑制率=(1-藥物組平均A490 nm/對照組平均A490 nm)×100%。

1.2.3 Annexin Ⅴ/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數生長期的A549細胞，按處理條件分為A組(空白對照組)、B組(DDP組)、C組(DDP加NanoFe3O4組)和D組(NanoFe3O4組)。B組加5 μg·ml-1DDP，C組加5 μg·ml-1DDP和25 μg·ml-1NanoFe3O4，D組加25 μg·ml-1NanoFe3O4。加藥24 h后收集細胞，PBS洗滌2次，采用AnnexinⅤ和PI熒光染色流式細胞術定量分析細胞凋亡率。

1.2.4 RTPCR檢測抗凋亡基因bcl2、survivin、ERCC1表達 按上述分組處理收集細胞，Trizol法提取總RNA，按TaKaRa兩步法試劑盒提供的說明書進行RTPCR操作。bcl2：上游引物5′GGGAGAACAGGGTACG

ATAA3′，下游引物5′CCACCGAACTCAAAGAAGG3′，產物長度452 bp;survivin：上游引物5′CAAGGACCACC

GCATCTC3′，下游引物5′CCAAGGGTTAATTCTTCAA

ACT 3′，產物長度255 bp;ERCC1：上游引物5′CCG

CCAGCAAGGAAGAAA 3′，下游引物5′CTGCCGAGG

GCTCACAAT3′，產物長度276 bp;內參為GAPDH。RTPCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，數字成像系統拍照分析。

1.2.5 蛋白印跡法分析多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance associated protein， MRP)及其表達率 收集藥物處理前后的細胞提取總蛋白。取樣進行SDSPAGE電泳，將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜，用含1%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉4 h后，加入1∶1 500稀釋MRP單抗，于4 ℃孵育過夜;TBST漂洗3次，加入二抗，37 ℃搖床溫育2 h，系統顯色。以等量內參蛋白作為對照，將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統分析。

1.3 統計學處理

實驗所得數據以x-±s表示，利用SPSS 13.0軟件包進行統計學分析，多組間的比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 MTT法檢測

MTT法檢測結果顯示：單純25 μg·ml-1NanoFe3O4(D組)對A549細胞的生長抑制率與對照組(A組)相比差異無顯著性(P>0.05);隨DDP濃度遞增，A549抑制率逐漸增高。DDP聯合NanoFe3O4的C組抑制率明顯高于相應濃度DDP組(B組)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。表1 單用DDP或聯合NanoFe3O4對A549細胞毒性作用

2.2 各組A549細胞凋亡率檢測

根據MTT結果選取終質量濃度為5 μg·ml-1的DDP和25 μg·ml-1的NanoFe3O4干預細胞。A、B、C、D組細胞24 h的凋亡率依次為5.1%、46.5%、60.6%、5.0%(圖1)。

2.3 bcl2、survivin、ERCC1等抗凋亡基因表達水平

在A549細胞中存在bcl2、survivin、ERCC1 mRNA的異常表達。以5 μg·ml-1的DDP和25 μg·ml-1的NanoFe3O4干預細胞，作用24 h后，bcl2、survivin、ERCC1 mRNA的表達情況見圖2。以GAPDH灰度值為參照，經圖像處理系統分析得出目的基因表達的半定量結果：DDP組、DDP加NanoFe3O4組與空白對照組比較，bcl2、ERCC1 mRNA表達有逐漸減少趨勢(P<0.05)，而NanoFe3O4組與空白對照組基因表達量比較差異無統計學意義。肺腺癌A549細胞表達survivin mRNA，但4組差異不具有統計學意義。

2.4 多藥耐藥蛋白MRP表達水平變化

SDSPAGE電泳顯示，DDP組、DDP加NanoFe3O4組與空白對照組比較，MRP表達有逐漸減少趨勢，且DDP加NanoFe3O4組與DDP組間MRP表達差異也具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

耐藥及凋亡相關基因的過度表達是MDR的重要發病機制。有學者將MRP、LRP等耐藥蛋白所介導的MDR稱為近端機制，凋亡介導的MDR稱為遠端機制[4]。包括bcl2、survivin、ERCC1在內的細胞凋亡相關基因在MDR中的作用以及兩種機制之間的關系，近年來引起業內關注。研究表明，許多臨床常用的腫瘤化療藥物均能誘導腫瘤細胞凋亡，凋亡可能是多數化療藥物細胞毒作用的最終共同途徑，而參與凋亡過程調控基因的表達失控可能導致腫瘤細胞對多種化療藥物耐受[5]。參與凋亡抑制的基因主要包括bcl2家族、凋亡抑制蛋白家族(inhibition of apoptosis protein，IAP)。本實驗通過MTT、流式細胞術檢測得出DDP聯合NanoFe3O4組對肺癌細胞A549抑制率明顯高于相應濃度DDP組，早期腫瘤細胞凋亡率增高，提高了DDP療效。本實驗通過檢測凋亡相關基因及耐藥蛋白的變化，進一步探索NanoFe3O4聯合DDP增敏化療的機制。

bcl2是目前研究最深入也是最重要的細胞凋亡抑制基因之一。Bcl2家族蛋白是一種膜整合蛋白，通過抗氧化、調節胞內Ca2+濃度、調節蛋白跨膜轉運以及與信號轉運蛋白結合、調控信號通路等機制參與MDR形成。在bcl2過度表達的細胞，化療藥物仍能進入細胞內，誘導細胞損傷，但這種損傷不能有效地轉換成凋亡的信號，以致在化療期間表達bcl2的腫瘤細胞又能以較快的速率重新生長，導致MDR的產生[6]。本實驗通過灰度值半定量比較顯示，NanoFe3O4聯合DDP的C組bcl2 mRNA表達水平明顯低于其余3組，且空白組(A組)、DDP組(B組)、DDP聯合NanoFe3O4組(C組)bcl2 mRNA表達水平依次遞減(除NanoFe3O4組與空白對照組無統計學差異)，差異均具有統計學意義(P<0.05)。該結果初步說明在A549中，NanoFe3O4可能通過下調bcl2來促進凋亡，從而增敏化療。

survivin是IAP的新成員，具有抑制凋亡和調節細胞增殖的雙重作用，是迄今發現最強的凋亡抑制因子，其編碼的蛋白由142個氨基酸組成，相對分子質量約為16 500[7]。survivin組織分布有明顯的選擇性，除胚胎組織外，在正常成人組織中(除胸腺和生殖腺)不表達，在幾乎所有惡性腫瘤組織內均有表達[810]。目前，survivin已經成為非小細胞肺癌最顯著的獨立預后影響因子之一[11]。而本實驗肺腺癌A549細胞表達survivin mRNA，但4組差異不具有統計學意義，作者認為可能與survivin與bcl2抑制細胞的凋亡機制不同有關。bcl2通過干擾細胞色素C自線粒體的釋放而阻斷caspase蛋白酶連鎖反應的激活，而survivin在bcl2的下游直接抑制caspase蛋白酶。此外，國內學者研究A549耐DDP細胞株不管是否用VP16處理，均不表達survivin mRNA，推斷survivin并不參與A549/R細胞MDR的產生機制[12]。

ERCC1(切除修復交叉互補基因)是核苷酸切除修復系統(nucleotide excision repair，NER)途徑的關鍵基因，其表達產物與著色性干皮病基因F (xeroderma pigmentosum pomplementary group，FXPF)形成異二聚體，ERCC1/XPF具有識別損傷DNA的功能，而且具有5′及3′核酸內切酶的活性，參與了對鉑DNA加合物的損傷修復，研究證實其表達升高與多種腫瘤DDP耐藥有關[13]。缺失有功能ERCC1的細胞不能修復DDP所致的DNA損傷[14]。ERCC1過表達可使停滯在G2/M期的損傷DNA迅速修復，導致其對DDP耐藥。本實驗RTPCR測得DDP加NanoFe3O4組的ERCC1 mRNA表達水平低于DDP組，且組間存在統計學差異(P<0.05)，與既往研究結果一致。

MRP屬ATP結合轉運蛋白超家族成員，又稱GSHX泵。通過轉運GSX復合物，參與胞質囊泡的運輸，從而降低胞內的藥物濃度，增加外排產生耐藥[15]。MRP介導親脂性抗癌藥物的耐藥，過度表達MRP的細胞可通過抗凋亡基因的過度表達與下調前凋亡基因而抵抗化療藥物誘發的凋亡[16]。本實驗DDP加NanoFe3O4組MRP的表達量低于其余各組，與bcl2表達趨勢一致。國內外研究表明，MRP不僅與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達具有顯著正相關性，同時與bcl2表達亦呈顯著正相關[17]。本實驗與該結論一致，說明耐藥蛋白與凋亡相關因子之間存在密切聯系。

目前利用納米材料作為藥物載體，提高腫瘤細胞胞內化療藥物濃度，逆轉耐藥、增強化療敏感度，已成為研究熱點[18]。NanoFe3O4是帶有正電荷的基團，生理狀態下存在，具有安全、制備簡單、生物相容性較好的優勢，在生物醫學領域具有良好應用前景[3]。但其到底通過何種途徑增敏化療，目前尚不清楚。凋亡相關基因與MDR基因之間關系密切，已有學者提出聯合檢測，可作為篩選鉑類方案的指標[19]。本實驗通過檢測凋亡相關基因及MRP，證實NanoFe3O4聯合DDP在一定程度上可下調A549 bcl2、ERCC1及MRP的表達，從而增敏化療。細胞凋亡相關基因與MDR基因的相關性也為肺癌耐藥逆轉及基因治療提供了一個新的研究方向。