作者：莊克虎，王春雨，張宇，顧寧

【摘要】 目的：研究聚集和表面分子吸附對磁性納米粒子交流磁化率的影響，為發展基于磁性納米粒子磁化率測量的生物傳感方法提供依據。方法：用透射電子顯微鏡及振動樣品磁強計分別對磁性納米粒子的磁核粒徑、磁性特征進行測量，利用實驗室自建的交流磁化率測量裝置，對在不同聚集狀態和表面吸附抗原、抗體等生物分子后磁性納米粒子的交流磁化率譜進行測量。結果：透射電子顯微鏡測量表明，實驗所用氧化鐵納米粒子平均磁核直徑10 nm，但是由于溶液中粒子之間的磁偶極相互作用而以聚集體的形式存在，表現出較大的水動力尺寸及其分布。振動樣品磁強計測量表明，氧化鐵納米粒子的飽和磁化強度為61.43 emu·g-1。交流磁化率譜測量表明，隨著氧化鐵納米粒子在溶液中水動力尺寸的增加，即聚集體尺寸的增加，磁化率譜中對應的磁動力學特征頻率減小，與理論預示一致。當緩沖溶液中磁性納米粒子表面吸附IgG以及進一步結合羊抗人IgG后，磁動力學特征頻率逐漸降低，這與表面吸附導致的水動力尺寸逐漸增加的結果是一致的。結論：溶液中磁性納米粒子的聚集狀態和生物分子吸附對其交流磁化率譜有較大的影響，主要表現為粒子的水動力尺寸增加所導致的磁動力特征頻率發生移動。基于磁性納米粒子的磁動力特征頻率的變化，可望發展成為一種研究磁性納米粒子表面生物分子相互作用的生物傳感方法。

【關鍵詞】 磁性納米粒子； 交流磁化率； 聚集； 表面吸附； 生物傳感

［Abstract］ Objective:To investigate the effect of aggregation and surface molecular adsorption on AC susceptibility of magnetic nanoparticles，which will provide a basis for biosensing based on AC magnetic susceptibility measurement.Methods:Using transmission electron microscopy and vibrating sample magnetometer， the magnetic nanoparticles magnetic core size，magnetic characteristics were measured respectively.Using selfbuilt AC susceptibility measuring device，magnetic nanoparticles，with different aggregation states and surface adsorption of antigen，antibody and other biomolecules，susceptibility spectra were measured.Results:TEM study showed that the magnetic nanoparticles have a magnetic core size of about 10 nm.Because the magnetic dipole interaction between nanoparticles，the particles exist in the form of aggregates and show a larger hydrodynamic size distribution.VSM measurement showed that the saturation magnetization(Ms) was about 61.43 emu·g-1.AC magnetic susceptibility spectrum measurement showed that with the hydrodynamic size increases of nanoparticles in the solution，that was， the size increase of the aggregates，the characteristic frequency decreases of the AC magnetic susceptibility spectra，which was consistent with the theory.The study also indicated that when magnetic nanoparticles adsorbed IgG and subsequently conjugated goat anti human IgG，the magnetodynamic characteristic frequency gradually decreased，which was consistent with the result of the increase in hydrodynamic size.Conclusions:The magnetic nanoparticle aggregation and surface biological molecule adsorption in solution affect strongly AC magnetic susceptibility spectrum，i.e.，change the magnetodynamic characteristic frequency，resulting from the increase of nanoparticles hydrodynamic size.Based on the magnetic nanoparticles magnetodynamic characteristic frequency changes， so，it is expected to develop into a biological detection method to sense biological molecule interactions on the surface of magnetic nanoparticles.

［Key words］ magnetic nanoparticles; AC magnetic susceptibility; aggregation; surface adsorption; biosensing

磁性納米粒子在細胞磁分離［1］、磁靶向藥物輸運［2］、生物傳感［3-4］、磁共振成像(MRI)［5-6］及磁感應腫瘤熱療［7-10］等生物醫學方面的應用已得到了廣泛和深入的研究。其中，基于磁性納米粒子豐富的磁學特性進行生物傳感方法的設計和應用是一個重要和快速發展的領域［11］。利用抗體等特異性生物分子探針修飾磁性納米粒子構建磁標簽，并對靶分子(或細胞)進行識別和標記，然后利用對磁標簽敏感的技術進行測量，即可實現對磁標簽所標記的生物結合事件進行檢測和傳感。這些磁敏感技術包括MRI［12］、超導量子干涉儀(SQUID)［13］以及基于其他磁學效應或特性(如各向異性磁阻抗等［14］)的磁場傳感器。發展這樣的生物檢測和傳感平臺已經成為目前研究的熱點，并且它們在靈敏性、特異性、定量性和檢測速度上已經展示出許多優勢，但是它們需要對傳感元件(敏感部位)進行復雜的材料和結構設計，是一種基底上的(substratebased)檢測方法。這里我們將探索一種新的無基底(substratefree)的傳感方法，它能夠傳感溶液中的包含磁標簽的生物分子結合事件。磁化率是描述物質磁化性質的重要物理量。根據物質結構的電子理論可以證明，物質的磁化率與其微觀結構有十分密切的關系。因此，測定物質磁化率，可以獲得物質微觀結構的許多信息。隨著磁性納米粒子在生物傳感及生物醫學方面的應用，基于其磁動力特征的研究也越來越廣泛。 1 材料和方法 1.1 材料與試劑 γFe2O3納米粒子及2，3二巰基丁二酸(DMSA)修飾的γFe2O3納米粒子(DMSA@γFe2O3)由江蘇省生物材料與器件重點實驗室王春雨同學根據我們研究組先前報道［15-16］的方法制備得到。硼酸鹽緩沖溶液由19.07 mg·ml-1四硼酸鈉溶液和19.07 mg·ml-1硼酸溶液按4∶1比例混合而成，pH=9.0。IgG及羊抗人(goat anti human，GAH)IgG購自南京凱基生物科技發展有限公司，使用時濃度稀釋為1 mg·ml-1。實驗用水為超純水(艾科普超純水機提供)。 1.2 方法

1.2.1 表征測量

磁性納米粒子磁核尺寸測量使用透射電子顯微鏡(TEM)(南京大學分析測試中心，儀器型號為JEM200CX)；水動力尺寸測量使用光子相關光譜儀(PCS)(東南大學生物電子學國家重點實驗室，儀器型號為N4 Plus)；磁性測量使用振動樣品磁強計(VSM)(東南大學生物電子學國家重點實驗室，儀器型號為Lake Shore 7400)；磁化率測量采用實驗室自建的交流磁化率測量儀，所用鎖相放大器為美國斯坦福研究系統的雙通道數字鎖相放大器SR830（圖1）。 圖1中所用線圈組合中原線圈的匝數為75匝，副線圈的匝數為48匝。原線圈的規格是Φ20 mm×100 mm，每個副線圈的規格是Φ10 mm×15 mm。樣品放置在線圈組合裝置的副線圈的正中央。所采用的激發信號是由鎖相放大器的正弦(SINE OUT)端提供的，通過鎖相放大器上的雙通道(CH1、CH2)輸出來到檢測信號。

1.2.2 基于磁性納米粒子交流磁化率測量進行生物傳感的理論與方法

溶液中磁性納米粒子的交流磁化率χ包含兩部分：實部磁化率χ′和虛部磁化率χ″［17］，χ=χ′+i χ″德拜理論對磁性納米粒子交流磁化率的頻率依賴關系可以描述為：χ(ω)=χ0/(1+iωτ)，其中χ0為直流磁化率。實部磁化率χ′和虛部磁化率χ″可以表示為：χ′=χ0/1+(ωτ)2，χ″=χ0ωτ/1+(ωτ)2其中，τ是納米粒子在溶液中的弛豫時間，ω=2πf為角頻率， f為圓頻率。當ωτ=1時，磁化率的虛部部分出現一個最大值。χ″～ω譜的峰值頻率ωchar=1/τ，為溶液中納米粒子磁弛豫過程的特征頻率。 分散在溶液中的磁性納米粒子磁化后，一般通過兩種機制進行弛豫：Brownian弛豫和Néel弛豫。一般來說，有效弛豫取決于兩種弛豫機制的結合。但是，依賴于使用的磁性納米粒子的尺寸，其中一種機制將起支配作用。 當磁性納米粒子具有較大尺寸或在溶液中存在聚集體時，Brownian弛豫是支配的機制［18］。這種情況下，Brownian弛豫時間為：τB=4πr3η/κBT這里，r為納米粒子的水動力半徑，η為溶液的粘滯系數，κB為波爾茲曼常數，T為溶液的絕對溫度。可見Brownian弛豫時間τB與r3成正比，對應的Brownian弛豫特征頻率ωB=1/τB，與r3成反比。這樣，一旦靶分子(如抗原)被結合到磁標簽(抗體標記的磁性納米粒子)上，增加的水動力半徑將導致Brownian弛豫特征頻率以r3關系減小，并且靶分子越大，ωB減小越多。同樣溶液中磁性納米粒子的聚集也會導致ωB減小。 在交流磁化率的測量實驗中，常用的方法是認為鎖相放大器的兩個通道上的輸出電壓就是磁性液體交流磁化率的實部磁化率和虛部磁化率［19］。即：V=V′+i×V″，χ=χ′+i×χ″ V′=χ′，V″=χ″ 2 結果 2.1 γFe2O3納米粒子的TEM表征 圖2顯示：氧化鐵納米粒子磁核接近球形，平均尺寸為10 nm；DMSA修飾后的氧化鐵納米粒子表示了同樣的結果。這說明表面修飾沒有改變磁性納米粒子的磁核尺寸。我們注意到，有機小分子DMSA由于在電鏡下襯度低，因此，觀察不到粒子表面修飾層的存在。 2.2 磁性測量 圖3顯示：表面修飾DMSA后，氧化鐵納米粒子的飽和磁化強度為53.53 emu·g-1(a)，與修飾之前的值61.43 emu·g-1(b)相比略有降低，這是由于樣品中非磁性有機分子的存在，使得單位質量樣品的磁化強度有所降低［20］。γFe2O3與DMSA@γFe2O3磁性納米粒子的矯頑力分別為0.25O e和0.14O e，表明樣品接近超順磁性。理論上，具有10 nm磁核尺寸的磁性氧化鐵納米粒子已經達到超順磁尺寸，具有零矯頑力［21］。樣品中微小矯頑力的存在可能是由于粒子間聚集體的存在。 2.3 聚集和表面分子吸附對磁性納米粒子水動力尺寸的影響

見表1、2。表1 γFe2O3及解膠前、后DMSA@γFe2O3納米粒子在水溶液中(pH=7)的水動力平均直徑（D）（略）

表2 DMSA@γFe2O3納米粒子在pH 9.0硼酸鹽緩沖溶液及依次加入IgG和GAH IgG后的水動力平均直徑（略）

溶液中納米粒子水動力尺寸是指包括表面有機物殼層和水化層在內的總的尺寸，一般大于納米粒子核尺寸。用光子相關光譜儀(PCS)測量了γFe2O3與DMSA@γFe2O3磁性納米粒子在水溶液中的水動力平均直徑（D），結果如表1所示。可以看到，表面修飾前γFe2O3納米粒子的水動力平均直徑為92 nm，遠大于TEM所測得的平均磁核尺寸(10 nm)。解膠前DMSA@γFe2O3磁性納米粒子的水動力直徑為110 nm，大于γFe2O3納米粒子的水動力直徑(92 nm)，這一方面是由于聚集效應，另一方面還歸于表面DMSA修飾層的貢獻。解膠后，DMSA@γFe2O3納米粒子的水動力平均直徑減小為75 nm。 DMSA@γFe2O3磁性納米粒子在硼酸鹽緩沖溶液以及依次加入IgG和GAH IgG后，磁性納米粒子的水動力直徑發生了變化。從表2可以看到，DMSA@γFe2O3磁性納米粒子在硼酸鹽緩沖溶液中平均水動力直徑為78 nm，略大于水溶液中的水動力尺寸(75 nm)。當在含有DMSA@γFe2O3磁性納米粒子的硼酸鹽緩沖溶液中加入IgG后，磁性納米粒子的水動力直徑變為88 nm，進一步加入GAH IgG后，磁性納米粒子的水動力直徑繼續增加，變為136 nm。 2.4 聚集和表面分子吸附對磁性納米粒子交流磁化率的影響

見圖4。 圖4表示了γFe2O3及解膠前后DMSA@γFe2O3磁性納米粒子在水溶液中的交流磁化率譜，實線表示對實驗數據的理論擬合。由圖4可知，3種不同的磁性納米粒子交流磁化率的虛部依次在142 Hz(a)、119 Hz(b)以及160 Hz(c)處出現一峰值，即Brownian弛豫特征頻率先減小再增加。這與表1所示相同條件下水動力尺寸先增加再減小一致，符合理論預示結果。

3 討論 本研究觀察了聚集和表面分子吸附對磁性納米粒子交流磁化率的影響，主要研究了Brownian弛豫特征頻率ωB與溶液中磁性納米粒子聚集和表面吸附的關系，以期通過磁化率測量來傳感磁性納米粒子聚集和表面分子吸附的事件。這里，ωB=κBT/4πr3η特征頻率ωB與溶液中磁性納米粒子的水動力學半徑成3次方反比關系。因此，溶液中磁性納米粒子的聚集和表面生物分子吸附主要通過對水動力尺寸的改變來影響其特征頻率。本研究同時采用光子相關光譜儀對溶液中磁性納米粒子的水動力尺寸進行測量來加以驗證。 TEM研究表明，γFe2O3及DMSA@γFe2O3磁性納米粒子的平均磁核直徑為10 nm，而用PCS測量得到的水動力平均直徑遠大于納米粒子的平均磁核尺寸，粒子表面的水化層不可能導致如此大的水動力尺寸，因此，納米粒子以一定尺寸分布的聚集體的形式存在于溶液中。一般來說，磁偶極相互作用和范德瓦爾茲力是導致這種聚集的原因［22］。通過合適的表面修飾(包括物理吸附和化學吸附)，在表面引入更多的電荷和有機分子阻擋層可以改善這種聚集。DMSA分子具有雙巰基和雙羧基結構，其化學吸附到γFe2O3納米粒子表面，使得在粒子表面上引入較多的羧基基團—COOH。通過解膠，即用堿來解離羧基上的氫，可以使粒子表面帶上更多的負電荷，從而通過粒子間的靜電排斥使納米粒子變得更分散，水動力尺寸得到降低。解膠前DMSA@γFe2O3磁性納米粒子的水動力直徑為110 nm，大于γFe2O3納米粒子的水動力直徑，這一方面是由于聚集效應，另一方面還歸于表面DMSA修飾層的貢獻。解膠后，DMSA@γFe2O3納米粒子的水動力平均直徑減小為75 nm，這與前述分析相一致。解膠后的DMSA@γFe2O3納米粒子由于具有更小的水動力尺寸和更高的表面電荷，使得其在水溶液中更加穩定，即使在離子強度較高的緩沖溶液(如pH=9.0硼酸鹽緩沖溶液和pH=6.0檸檬酸緩沖溶液)中也表現出很好的穩定性，這為進一步研究在緩沖溶液中粒子表面吸附抗原、抗體的結合事件提供了保證。 磁性納米粒子由于聚集以及表面生物分子吸附導致其水動力直徑的變化為交流磁化率的測量提供了前提，因為交流磁化率譜峰的特征頻率與粒子的水動力尺寸有3次方反比關系。通過對解膠后DMSA@γFe2O3(D=75 nm)，γFe2O3納米粒子(D=92 nm)及解膠前DMSA@γFe2O3(110 nm)磁性納米粒子交流磁化率的測量，得到交流磁化率譜峰的特征頻率依次出現在160 Hz、142 Hz及119 Hz處，表現出與理論一致的關系。為了進一步研究表面分子吸附對磁性納米粒子交流磁化率的影響，我們還測量了分散在pH 9.0的硼酸鹽緩沖溶液中的磁性納米粒子以及依次加入IgG和GAH IgG后的交流磁化率，其譜峰特征頻率依次出現在150、140及100 Hz左右，與對應的水動力直徑(78、88和136 nm)相對應，符合理論關系。這里，磁性納米粒子作為溶液中的磁敏感探針，能夠靈敏地反映其表面上生物分子吸附及特異性識別的事件，為發展新的生物傳感方法提供了思路。 這種傳感方法優點在于在交流磁化率的測量中不受游離的抗原及抗體等生物分子的影響，在檢測過程中不需要后續的分離和洗滌處理，磁化率測量設備易于搭建，成本低，因此該方法具有更強的實用性。另外一些可以預見的優勢是，該方法可以區分不同大小的生物分子在納米粒子表面的吸附，以及生物分子誘導的特異性磁性納米粒子聚集。 當所測磁性液體的粘滯系數及絕對溫度等因素不變時，磁化率譜特征頻率的變化只與磁性納米粒子的水動力尺寸及尺寸分布有關。窄的粒子尺寸分布能夠降低磁化率譜的寬度，從而可進一步增加檢測的靈敏度。因此，選擇單分散磁性納米粒子做為磁敏感探針，將有望大大提高此生物傳感方法的檢測精度。