【摘要】 目的：研究局部使用磁性納米鐵熱療對大鼠膠質(zhì)瘤的治療效果。方法:將傳代培養(yǎng)的C6細胞立體定向接種于SD大鼠的尾狀核，14 d后腫瘤生長至直徑0.5～1.0 cm時隨機分成對照組和3、5、8 mg磁性納米鐵熱療組，分別立體定向注入等體積的生理鹽水及3、5、8 mg的磁性納米鐵，于交變磁場中連續(xù)熱療3次，每次30 min，觀察大鼠的生存時間及腫瘤體積變化。免疫組織化學SP法檢測bcl2和bax蛋白表達。結果：腫瘤熱療3次后3、5、8 mg磁性納米鐵熱療組大鼠的生存時間分別為(19.60±1.43)、(18.90±1.75)、(20.40±2.26) d，明顯長于對照組［(13.30±1.69) d，P＜0.05］，各劑量磁性納米鐵熱療組bax蛋白表達亦明顯強于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)；各劑量磁性納米鐵熱療組間bax蛋白表達、bcl2蛋白表達及生存時間比較差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。結論:磁性納米鐵熱療能有效地促進大鼠膠質(zhì)瘤細胞凋亡，抑制腫瘤增殖，延長荷瘤鼠的生存期。磁性納米鐵熱療能促進bax蛋白的表達，對bcl2蛋白表達影響不明顯。

【關鍵詞】 膠質(zhì)瘤； 納米鐵； 熱療； 凋亡 [Abstract] Objective: To explore the efficacy of magnetic nanoiron hyperthermia on rat glioma. Methods: C6 cells were injected in the SD rat caudate nucleus by means of subculture of stereotactic inoculation. After 14 days when the glioma had growed to 0.5～1.0 cm in diameter， the rats were pided into four groups randomly and then the magnetic nanoiron(3， 5， 8 mg ) or an equal volume of physicological saline were injected respectively. After finishing the magnetic nanoiron treatment for three times in alternating magnetic field and keeping 30 min for each time， the survival time of rats and the change of tumor volume were observed and the protein expression of bcl2 and bax were detected by the method of immunohistochemistry SP. Results: The survival time of rats in the magheticnanoiron 3， 5， 8 mg groups was(19.60±1.43) days，(18.90±1.75) days，(20.40±2.26) days， respectivety. Which were significantly higher than that of control group［(13.30±1.69) days，P＜0.05］. The expression of bax protein in the magheticnanoiron groups was also significantly stronger than that of control group(all P＜0.05). The expression of bax protein， bcl2 protein and the survival time among the treatment groups had not difference(all P＞0.05). Conclusions: Magnetic nanoiron hyperthermia can effecttively promote cell apoptosis in rat glioma， inhibit tumor proliferation and prolong the survival time of tumor bearing rat. Magnetic nanoiron hyperthermia can promote the expression of bax protein， but the bcl2 expression of protein is not obvious．

[Key words] glioma； nanoiron； hyperthermia； apoptosis 膠質(zhì)瘤(glioma)起源于神經(jīng)外胚層，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤(平均占44.69%)［1］。由于生長位置特殊、惡性程度高以及血腦屏障的存在，臨床上膠質(zhì)瘤治療效果極差。近來研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤對熱療敏感。作者在建立大鼠膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型的基礎上，通過立體定位向腫瘤內(nèi)注入不同劑量的磁性納米鐵進行熱療，并與對照組進行比較，探討磁性納米鐵熱療是否可以使腫瘤縮小、延長荷瘤鼠的生存期以及磁性納米鐵熱療是否能夠影響bax、bcl2蛋白表達、促進腫瘤細胞凋亡。 1 材料與方法 1.1 材料 SD健康大鼠80只，體重280～300 g，雌雄不限，購于東南大學動物實驗中心。大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞株購于中國科學院上海生物研究所，大鼠bax、bcl2蛋白單克隆抗體為美國Santa Cruz產(chǎn)品，交變磁場機器及磁性納米鐵顆粒(15 nm)由東南大學生物醫(yī)學工程系提供。 1.2 方法

1.2.1 C6膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)

細胞分裝于底面積為50 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入適量體積分數(shù)為2.5%胎牛血清、15%馬血清的F12K培養(yǎng)液，置于溫度為37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，單層培養(yǎng)法傳代培養(yǎng)生長至所需的細胞數(shù)，在細胞對數(shù)生長期培養(yǎng)瓶大約滿85%時，以0.25%胰酶消化(不含EDTA)，收集消化液，離心后去除上清液，F(xiàn)12k液洗2次后制成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞濃度為［1×107·(10 μl)-1～1×108·(10 μl)-1］，置于37 ℃恒溫搖床待接種；苔盼藍排斥實驗檢測顯示細胞活力＞95%。

1.2.2 膠質(zhì)瘤細胞腦內(nèi)原位接種

用1%的戊巴比妥鈉按照［0.4 ml·(100 g)-1］劑量行腹腔注射麻醉后，將大鼠頭部固定在腦立體定向儀上，剪去頭頂部毛發(fā)，碘酒、乙醇消毒后鋪孔巾。內(nèi)眥連線與頭部正中定位儀引導下，根據(jù)Batker法確定右尾狀核靶點，于冠狀縫前1 mm、中線右旁開3 mm處用圓頭牙科鉆鉆一孔徑約1.2 mm的小孔，深達硬腦膜表面但不傷及腦組織；以25 μl微量注射器抽取10 μl單細胞懸液，沿骨孔緩慢垂直進針至硬腦膜下6 mm，再回退1 mm，以1 μl·min-1的注射速度勻速緩慢注射10 μl腫瘤細胞，注射完畢后留針5 min，緩慢拔針，骨蠟封閉骨孔。生理鹽水沖洗手術野，皮膚消毒后4號線縫合切口。

1.2.3 膠質(zhì)瘤生長觀察及體積大小的評估

接種后每2 d行MRI掃描，觀察腫瘤大小及生長情況，測量腫瘤的最大長徑(a)和最大寬徑(b)，計算腫瘤體積(V=a×b2/2)；接種14 d后腫瘤直徑為0.5～1.0 cm時隨機將80只大鼠分成生理鹽水對照組及3、5、8 mg磁性納米鐵熱療組4組，每組20只。

1.2.4 磁性納米鐵瘤內(nèi)注入

大鼠麻醉成功后將頭部固定于立體定向儀上，剃毛、消毒、鋪巾。原切口切開頭皮，尋找到原骨孔，以50 μl微量注射器分別抽取30 μl等體積的生理鹽水及3、5、8 mg磁性納米鐵立體定向注入相應的瘤區(qū)，行MRI掃描確認注入部位準確。

1.2.5 膠質(zhì)瘤熱療

交變磁場選擇頻率40 kHz，功率80 kW，磁感應強度0～100 kA·m-1，連續(xù)熱療 3 d，每日1次，持續(xù)時間為30 min。熱療結束后第2天每組取10只大鼠處死，取標本行光鏡、免疫組織化學檢測，余40只大鼠分籠飼養(yǎng)，觀察生存時間并做好死亡記錄。

1.2.6 光鏡檢查

大鼠處死后，無菌條件下迅速取出腦組織，分別固定于10%多聚甲醛，4 ℃冰箱固定24 h后，脫水、石蠟包埋、切片后染色，光鏡下觀察瘤區(qū)的細胞形態(tài)及密度。

1.2.7 免疫組織化學染色

腫瘤組織5 μm厚切片，常規(guī)脫蠟后水化，再經(jīng)0.01% mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)于微波爐內(nèi)處理15 min，然后加入一抗bcl2和bax，4 ℃冰箱孵育12 h；具體染色步驟嚴格按SP試劑盒說明進行。DAB顯色，細胞核作蘇木素襯染。陽性對照由南京凱基公司提供，陰性對照采用緩沖液代替一抗。Bax與bcl2結果判斷：腫瘤細胞中bax蛋白表達位于胞漿，胞漿中出現(xiàn)高出背景棕黃色的為陽性細胞；而腫瘤細胞中bcl2蛋白表達位于胞膜或胞漿內(nèi)，細胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色為陽性細胞。于400倍顯微鏡下計數(shù)1 000個細胞中的凋亡細胞，計算凋亡指數(shù)(apoptosis index， AI)，AI=凋亡細胞數(shù)/1 000×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗測定數(shù)據(jù)用x-±s表示，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，利用SPSS統(tǒng)計分析軟件處理各組數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 2 結果 2.1 各組大鼠膠質(zhì)瘤MRI表現(xiàn) 大鼠接種后13 d MRI掃描顯現(xiàn)腫瘤直徑可達到0.5～0.8 cm，位于尾狀核；立體定向注射磁性納米鐵顆粒連續(xù)熱療3次后，復查MRI顯示瘤體縮小，腦水腫減輕，中線歸位，磁性納米鐵位于瘤區(qū)(圖1、2)。

2.2 各組大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)瘤生長曲線 根據(jù)測量計算得出的腫瘤體積(V=a×b2/2)，繪制生長曲線(圖3)。從圖3可以看出，隨瘤齡延長對照組瘤體明顯增大，磁性納米鐵熱療組瘤體縮小，磁性納米鐵熱療組與對照組腫瘤體積比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各劑量磁性納米熱療組間腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 各組大鼠生存時間比較 對照組隨著時間的延長大鼠死亡只數(shù)迅速增加，平均生存時間為(13.30±1.69) d。3、5、8 mg磁性納米鐵熱療組荷瘤鼠生存時間明顯延長，平均生存時間分別為(19.60±1.43) d、(18.90±1.75) d、(20.4±2.26) d。磁性納米鐵熱療組與對照組荷瘤鼠生存時間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各劑量磁性納米鐵熱療組間荷瘤鼠生存時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(表1)。表1 各組荷瘤鼠生存時間的比較(略)

光學顯微鏡下觀察結果顯示，治療前腫瘤細胞密度高，呈浸潤性活躍生長，治療后瘤區(qū)細胞數(shù)明顯減少，瘤細胞形態(tài)萎縮，腫瘤組織中可見納米鐵顆粒沉積(圖4、5)。 2.5 bax、bcl2蛋白的表達 bax蛋白表達位于細胞漿，bcl2蛋白表達位于胞膜或胞漿中，呈片狀或散在分布。磁性納米鐵熱療可促進bax蛋白表達，加速膠質(zhì)瘤細胞凋亡，胞漿呈現(xiàn)棕色染色(圖6～8)。對照組與磁性納米鐵熱療組bax蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，磁性納米鐵熱療對bcl2蛋白表達影響不明顯(表2)。表2 各組荷瘤鼠bax、bcl2蛋白表達（略）

3 討論 3.1 磁性納米鐵熱療機制及使用現(xiàn)狀 膠質(zhì)瘤熱療是一類利用各種物理能量(如微波、射頻和超聲波等)在膠質(zhì)瘤組織中產(chǎn)生熱效應，使膠質(zhì)瘤組織溫度升高達到41～43 ℃有效治療溫度，并維持一定時間(一般為30 min)，以破壞腫瘤細胞的代謝，加速腫瘤細胞凋亡而對正常腦組織無損傷的方法。磁性納米鐵是一種在交變磁場中能夠迅速升溫的納米材料［2］。居里溫度［3-4］(Curie temperature， Tc)是磁場中某些物質(zhì)由磁性轉為非磁性的臨界溫度。在溫度＜Tc時，這些物質(zhì)顯示強磁性，強烈吸收電磁波能量而升溫；當溫度≥Tc時，它們轉為非磁性物質(zhì)，失去吸收電磁波能量升溫的能力。磁性納米鐵粒子就是一種具有較低Tc(4O～45 ℃)的溫敏材料。 當磁性納米鐵立體定向注入大鼠膠質(zhì)瘤后，由于磁滯效應、馳豫效應、疇壁共振等作用，在外磁場的照射下可以強烈吸收電磁波能量而升溫至41～43 ℃，并能平穩(wěn)維持30 min，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤的增殖，而對周圍正常腦組織損害較小。 膠質(zhì)瘤較其他惡性腫瘤對缺氧更敏感，同時具有低營養(yǎng)、低pH值、對熱耐受性低等特點。熱療可直接損傷細胞及周圍血管，使腫瘤組織中酶活性降低甚至喪失，細胞受熱出現(xiàn)核固縮、胞漿稀疏、有絲分裂障礙、胞體溶解及細胞膜結構受損等變化，溶酶體增多、活化；熱療還可以抑制DNA和RNA的合成及聚合，因此在細胞死亡之前，細胞內(nèi)難以進行大分子的合成，導致細胞難以修復。由于納米鐵粒子較小，可以被腫瘤細胞攝取并隨著細胞的分裂分布于子代細胞，這樣1次注射可以連續(xù)多次熱療，殺傷新的腫瘤細胞。磁性納米鐵熱療還可以使腫瘤微血管外徑變小，血管壁變厚，血管密度降低，血管內(nèi)皮細胞緊密連接增多，細胞連接間隙減小，有的血管甚至只能觀察到完整的基膜而缺乏內(nèi)皮細胞［5］，結果抑制腫瘤組織血管形成，減少了腫瘤血供，最終抑制腫瘤細胞增殖。