作者：楊婷，吳沂航，張曉慶，張宇，顧寧

【摘要】 目的：研究表面修飾對氧化鐵納米粒子類酶活性的影響。方法：用共沉淀法制備γFe2O3納米粒子，并用透射電子顯微鏡（TEM）表征。將γFe2O3納米粒子分別表面修飾二巰基丁二酸（DMSA）、檸檬酸、酒石酸和3氨丙基三乙氧基硅烷（APTS），并用Zeta電位儀表征。由于γFe2O3納米粒子可以催化雙氧水氧化底物3，3′，5，5′四甲基聯苯胺（TMB），從而發生顯色反應，這一特性與辣根過氧化物酶（HRP）相似，通過島津UV3600紫外可見分光光度計和酶標儀檢測該顯色反應，評估氧化鐵納米粒子的催化性能及表面修飾的影響。結果：（1） TEM和Zeta電位測量表明，γFe2O3納米粒子直徑約為13 nm，表面修飾能夠有效調控其表面電荷；（2） 氧化鐵納米粒子類過氧化物酶催化活性與納米粒子的表面電荷相關，表面負電荷有利于增加對帶正電荷底物TMB的親和力，從而增加類酶活性；（3） γFe2O3/DMSA具有最高的表面負電荷，米氏常數測量表明Km（TMB）為0.3 mmol·L-1，表現出與天然HRP對底物TMB類似的親和力。結論：通過表面修飾可以調控氧化鐵納米粒子的類酶活性，其作為HRP模擬酶具有潛在的應用價值。

【關鍵詞】 氧化鐵納米粒子； 表面修飾； 辣根過氧化物模擬酶

［Abstract］ Objective:To investigate the effect of surface modifications on the peroxidaselike activity of iron oxide nanoparticles.Methods:Magnetic iron oxide nanoparticles were prepared by coprecipitation method.The morphology of particles was observed by using TEM.The obtained γFe2O3 nanoparticles were modified with meso2，3Dimercaptosuccinic acid（DMSA），citric acid，tartaric acid and 3aminopropyltriethoxysilanes(APTS)，respectively，and the resultant products were characterized by zeta potential measurements.Like horseradish peroxidase（HRP），γFe2O3 nanoparticles were found to be able to catalyze a colour reaction of the substrate 3，3′，5，5′tetramethylbenzidine(TMB) in the presence of H2O2.The catalysis was evaluated by detecting the colour reaction using UVvisible spectrophotometer and microplat reader.Results:(1) TEM measurements showed that the mean diameter of γFe2O3 nanoparticles was 13 nm.(2) The peroxidaselike activity of γFe2O3 nanoparticles was found to be related to their surface charge.TMB carries two amine groups，likely yielding stronger affinity toward a negatively charged nanoparticle surfaces.（3）γFe2O3/DMSA nanoparticles with the strongest negative surface charge exhibited the highest peroxidaselike activity than others when TMB acts as a substrate.The kinetic parameter of γFe2O3/DMSA nanoparticles were determined to be Km（TMB）=0.3 mmol·L-1，exhibiting a similar enzyme activity to the natural HRP.Conclusions:The peroxidaselike activity of γFe2O3 nanoparticles can be readily regulated by surface modifications，thus providing a potential advantage for application as a HRP mimic enzyme.

［Key words］ iron oxide nanoparticles; surface modification; HRP mimic enzyme 磁性氧化鐵納米粒子因其具有多種獨特的功能，在生物、醫學、化學等領域受到廣泛的關注。同一種磁性氧化鐵納米材料可以作為磁共振成像對比劑［1-3］、磁靶向藥物載體［4］，可以用于細胞與生物分子分離［5］、生物傳感與檢測［6］，還可以作為磁感應腫瘤熱療的磁介質［7］。另外，在工業廢水處理方面，磁性氧化鐵納米粒子因具有較高的有機物羥基化的活性而用于苯酚等有毒物質的清除（苯酚等有機物羥基化后毒性降低）［8］。在氧化鐵磁性納米粒子的應用方面，一個體系內同時發揮其多種功能的研究，是目前更具有發展前景的工作。 過氧化物酶是廣泛存在于生物體內的一類氧化還原酶，通過其內部的變價鐵元素以及外部結構能催化H2O2氧化氫供體底物。在生命活動過程中，過氧化物酶主要是催化生物體內的氧化物或過氧化物氧化分解其他毒素。目前廣泛應用的過氧化物酶是從天然植物中提取的辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)。HRP價格昂貴，且保存及實驗條件苛刻，容易失活，在酶聯免疫分析上因其分子較大而不利于抗原抗體結合，并且標記過程復雜。因此，尋找能夠替代HRP的模擬酶是酶催化反應的熱點［9-10］。 在眾多酶模擬物中，Fe3O4磁性納米粒子最近被發現能像Fenton試劑一樣，表現出一定的類過氧化物酶活性，由此結合磁分離功能，能夠發展可同時進行磁分離富集和免疫檢測的方法［11］。由于Fe3O4納米粒子穩定性好、制備方法簡單、成本低、易于大規模制備，同時還兼具有磁性等其他多功能特性，因此在醫學、生物技術、環境化學等領域有廣泛的應用價值。γFe2O3是另外一種磁性較強的氧化鐵納米粒子，可由Fe3O4納米粒子直接氧化而來。由于γFe2O3磁性納米粒子中只含有三價鐵，因此，相對于Fe3O4納米粒子來說不易被氧化，具有良好磁學和化學穩定性。但是由于γFe2O3磁性納米粒子中缺乏二價鐵，其本身類酶活性大大降低，從而嚴重限制了其作為模擬酶的應用。作者通過表面修飾，提高γFe2O3磁性納米粒子類酶活性，從而得到一類穩定的、具有過氧化物酶活性的磁性γFe2O3納米粒子。 1 材料與方法

1.1 主要試劑 3氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）及3，3′，5，5′四甲基聯苯胺（TMB）購自SigmaAldrich公司（美國）。30%H2O2、醋酸鈉及冰醋酸購自國藥集團化學試劑有限公司。FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、二巰基丁二酸（DMSA）、檸檬酸及酒石酸購自上海凌峰化學試劑有限公司。 1.2 實驗方法

1.2.1 γFe2O3納米粒子的制備和小分子配體修飾

γFe2O3磁性納米粒子的制備及表面有機小分子修飾采用我們先前報道［12-13］的方法。（1） γFe2O3磁性納米粒子的制備［12］。在N2保護下制備Fe3+（FeCl3·6H2O，0.2 mol·L-1）和Fe2+（FeSO4·7H2O，0.13 mol·L-1）的混合溶液800 ml，將2.8 mol·L-1的氨水在劇烈的磁力攪拌下緩慢加入其中，直至pH=9，反應1 h，生成黑色沉淀，將生成物用永磁鐵分離出來，反復用去離子洗滌4遍。將制備得到的Fe3O4產物定容到6 L，用HCl（0.2 mol·L-1）調節溶液pH值到3.0，待pH值穩定后水浴升溫到90 ℃，鼓入過濾的空氣進行氧化（90 min），從而得到γFe2O3納米粒子。通過磁分離方法反復洗滌4遍后，定容約1 g·L-1，調pH=2.7。（2） γFe2O3/DMSA磁性納米粒子的制備［12］。稱取60.69 mg DMSA，用DMSO溶解，機械攪拌下加入到400 ml γFe2O3磁性納米粒子樣品中，繼續攪拌5 h，停止反應，磁分離洗滌沉淀物3次，加80 ml去離子水定容，用四甲基氫氧化銨調pH=6.5。（3） γFe2O3/檸檬酸磁性納米粒子的制備［13］。稱取52.6 mg檸檬酸，用10 ml去離子水溶解，機械攪拌下加入到400 ml γFe2O3磁性納米粒子樣品中，繼續攪拌5 h停止反應，磁分離洗滌沉淀物3次，加80 ml去離子水定容，用四甲基氫氧化銨調pH=6.5。（4） γFe2O3/酒石酸磁性納米粒子的制備［13］。取37.6 mg酒石酸，用10 ml去離子水溶解，機械攪拌下加入到400 ml γFe2O3磁性納米粒子樣品中，繼續攪拌5 h停止反應，磁分離洗滌沉淀物3次，加80 ml去離子水定容，用四甲基氫氧化銨調pH=6.5。（5） γFe2O3/APTS磁性納米粒子的制備［12］。取800 ml γFe2O3磁性納米粒子樣品，用無水乙醇磁分離洗滌3次，定容至600 ml，充分超聲。之后機械攪拌下在該反應體系中加入0.5 ml APTS，半小時后加去離子水100 μl，繼續攪拌3.5 h。停止反應后用無水乙醇磁分離洗滌沉淀物3遍，去離子水洗滌3遍，定容到160 ml，鹽酸調pH=3.85。

1.2.2 小分子配體修飾的γFe2O3納米粒子的表征

（1） 原子吸收測定Fe濃度：上述5個樣品各取100 μl，分別加1 ml濃鹽酸靜置12 h，充分反應將氧化鐵納米粒子溶解為鐵離子，再用去離子水定容至10 ml，待測。儀器型號為18080（日本Hitachi公司）。最終樣品統一定濃度為2.3 g·L-1。（2） 透射電鏡（TEM）表征：將γFe2O3樣品用去離子水稀釋后，滴1滴于TEM專用銅網上，40 ℃下真空烘干8 h，待測。儀器型號為JEM200EX。（3） Zeta電位儀表征不同小分子對γFe2O3納米粒子的修飾情況：將上述5個樣品去離子水充分洗滌除去溶液中電解質，定容后待測。儀器型號為ZetaMaster3000。 1.3 小分子配體修飾的γFe2O3納米粒子的類過氧化物酶催化性能研究

1.3.1 Fe3O4、γFe2O3/DMSA和γFe2O3納米粒子的催化能力比較

各個反應體系中，在石英比色皿內，分別取34 μg磁性納米粒子，溶于1 ml醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）中，加入50 μl TMB溶液（10 mg·ml-1，溶于DMSO）和160 μl的30%H2O2。用島津UV3600紫外可見分光光度計測得顯色反應10 min后的吸收光譜圖。

1.3.2 不同配體修飾γFe2O3納米粒子的催化能力比較

在各個反應體系中，分別取6.77 μg不同有機分子修飾的γFe2O3磁性納米粒子，溶于200 μl醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）中，加入10 μl TMB溶液（10 mg·ml-1，溶于DMSO）和32 μl的30%H2O2。在BIORAD 680酶標儀檢測650 nm下的光吸收值，掃描時間為1 200 s，反應溫度為25 ℃。

1.3.3 γFe2O3/DMSA納米粒子的米氏動力學實驗研究

（1） TMB的米氏常數測定。取6.77 μg γFe2O3/DMSA磁性納米粒子，溶于200 μl醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）中，加入13 μl的30%H2O2，分別加入不同量（0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 μl）的TMB溶液（10 mg·ml-1，溶于DMSO），BIORAD 680酶標儀檢測650 nm下的光吸收值，掃描時間120 s，反應溫度25 ℃。實驗重復3次取數據。（2） H2O2的米氏常數測定。取6.77 μg γFe2O3/DMSA磁性納米粒子，溶于200 μl醋酸鈉緩沖溶液（pH4.6）中，加入5 μl TMB溶液（10 mg·ml-1，溶于DMSO），分別加入不同量（0.7、1.3、2.6、5.2、7.8、10.4、13.0 μl）的30%H2O2，在BIORAD 680酶標儀檢測650 nm下的光吸收值隨時間變化，反應溫度25 ℃。實驗重復3次取數據。

圖3顯示了Fe3O4、γFe2O3及γFe2O3/DMSA納米粒子催化雙氧水氧化TMB顯色反應的紫外可見分光光度計測得的吸光譜圖。650 nm處是考察催化能力的特征吸收峰，即TMB氧化產物的吸收峰。在反應10 min的時候，Fe3O4納米粒子組的特征峰吸收值達到3.166；γFe2O3納米粒子的催化能力很弱，只能達到0.419；而通過表面修飾，γFe2O3/DMSA組的特征峰吸收值可以達到1.67；空白對照組是指不加催化劑條件下單純的雙氧水氧化TMB，可以看到反應很緩慢，10 min的時候幾乎見不到特征吸收峰。這說明與Fe3O4納米粒子比較，由于γFe2O3納米粒子中亞鐵離子的缺乏，使其催化能力變得很弱，當通過表面修飾DMSA后，其催化能力明顯提高。 圖4是不同配體修飾γFe2O3納米粒子催化雙氧水氧化TMB反應的對比示意圖。可以看出，在催化反應15 min的時候，催化能力的強弱是：γFe2O3/DMSA＞γFe2O3/檸檬酸＞γFe2O3/酒石酸＞γFe2O3/APTS＞裸γFe2O3。結合氧化鐵納米粒子修飾后表面電荷的數據，可知氧化鐵納米粒子表面電荷越偏負電，越有利于催化反應。這與底物TMB是多氨基的化學物質有著緊密的關系，其在酸性緩沖反應體系中質子化而帶正電荷，因此，表面荷負電荷越多的氧化鐵納米粒子越有利于吸附底物TMB，即具有更高的底物親和力，從而有利于加速雙氧水氧化TMB的反應。對于表面荷正電荷的氧化鐵納米粒子，由于表面和底物之間的排斥力，從而降低了催化效率。可見，通過合理的表面修飾，可以有效地調控氧化鐵納米粒子的類酶活性。由于納米粒子表面易于修飾和裁剪，因此為方便地調控這種模擬酶活性以及進一步的偶聯抗體等生物分子提供了保證。 為了更進一步的研究γFe2O3/DMSA納米粒子的模擬酶催化反應的機制，我們對其表觀穩態動力學參數Km進行了測定(圖5)。Km值是酶的特征性常數，只與酶的性質、酶所催化的底物和酶促反應條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關，與酶的濃度無關。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時，Km值也不同。各種酶的Km值范圍很廣，大致在10-1～10-6 mol·L-1之間。Km值愈大，酶與底物的親和力愈小；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達到最大反應速度［14］。 因為反應體系的氧化產物的濃度與檢測到的吸光度成正比，所以吸光度的變化速率與產物的生成速率成正比，即與體系的反應速率成正比。對酶催化反應速度和對應底物濃度，采用雙倒數法作圖，可求得γFe2O3/DMSA納米粒子模擬酶對各底物的Km。當以H2O2為底物時，γFe2O3/DMSA納米粒子對應的Km為176.84 mmol·L-1；而以TMB為底物，γFe2O3/DMSA納米粒子對應的Km為0.30 mmol·L-1。文獻中辣根過氧化物酶的Km（H2O2）為3.7 mmol·L-1，Km（TMB）為0.43 mmol·L-1［11］。這說明以H2O2為底物，Fe3O4納米粒子對應的Km比HRP要高，即為了獲得最大反應速度，需要較高濃度的氧化劑H2O2；而以TMB為底物，γFe2O3/DMSA納米粒子對應的Km比HRP要低，說明相對于HRP，γFe2O3/DMSA納米粒子對底物TMB具有更高的親和力，即不需要很高的底物濃度，便可容易地達到最大反應速度。 通過以上結果可知，對磁性γFe2O3納米粒子的表面修飾可以改變磁性γFe2O3納米粒子作為模擬酶的活性，這提供了一種裁剪和優化模擬酶活性和功能的方法，不僅能改善類酶活性，還能進一步增加納米粒子穩定性和生物相容性，此外其提供了表面進一步偶聯生物分子的功能基團，有利于標記蛋白、核酸等生物分子，使其很有潛力成為HRP的模擬酶用于生物檢測的實際應用。