作者：馬珺，孫新臣，徐睿智，趙迪，童金龍，葛小林

【摘要】 目的：通過制備3組尺寸的銀納米顆粒來研究其增強腦膠質瘤放射治療的效果。方法:采用檸檬酸鈉還原體系制備20、50和100 nm尺寸的銀顆粒，通過掃描電鏡來表征;檢測3種尺寸的銀納米顆粒的細胞毒性以及確定保證細胞活性的安全劑量;通過MTT比色法和集落形成實驗檢測3組尺寸的銀納米顆粒對腦膠質瘤細胞放射治療的效果;通過流式細胞術檢測銀納米顆粒對細胞周期以及細胞放療后凋亡率的影響。結果:20 nm的銀顆粒能夠顯著增強腦膠質瘤細胞的放射敏感性，50 nm的銀顆粒次之，而100 nm的銀顆粒無明顯效應。結論:小粒徑的銀納米顆粒能夠增強腦膠質瘤細胞的放射敏感性，為臨床放射治療提供新的前景。

【關鍵詞】 銀納米顆粒; 放射增敏; 存活分數(shù); 細胞凋亡

[Abstract] Objective： To study the effect of three types of silver nanoparticles on enhancing radiosensitivity of glioma cells. Methods: 20， 50 and 100 nm silver nanoparticles were all prepared in sodium citrate system and were characterized by SEM and TEM. The cytotoxicity was tested and the proper dose was determined to guarantee the little effect on cell viability. The effect of silver nanoparticles on radiosensitivity of glioma cells was detected by MTT assay and colonyforming assay. The cell cycles and apoptosis after irradiation were tested by FCM. Results: 20 nm silver nanoparticles significantly sensitized the effect of irradiation treatment upon cancer cells. 50 nm silver nanoparticles had less effect and 100 nm silver nanoparticles had little. Conclusion: Small size of silver nanoparticle can efficiently enhance cytotoxicity of irradiation of glioma， which provide new prospect for clinical radio therapy.

[Key words] silver nanoparticles; enhancing radiosensitivity; survival fraction; apoptosis

銀納米顆粒在生物醫(yī)學領域有很多應用價值，它可以作為高性能的抗菌材料[1-4]、光學傳感器和生物標記物[5-7]。除此以外，銀納米顆粒還能夠抑制病毒的復制，具備抗病毒的功效[8-10]。最近一項研究[11]顯示，銀納米顆粒能夠進入癌細胞線粒體和胞核中，并可以直接對癌細胞的線粒體產(chǎn)生毒性，損傷癌細胞的DNA。該研究認為銀納米顆粒破壞了癌細胞線粒體的呼吸作用，增加了活性氧的產(chǎn)物，中止了ATP的合成，反過來導致了DNA的受損。DNA的損傷通過銀納米顆粒和DNA相互作用進一步增大，導致了細胞分裂在G2/M期停滯。因此，銀納米顆粒被認為在癌癥治療中具有開發(fā)的潛力和價值。作者在上述前人研究的基礎上，提出了使用銀納米顆粒作為腫瘤放療的增敏劑，旨在提高腫瘤細胞放射敏感性，增強X射線對腫瘤細胞的殺傷作用。

1 材料和方法

1.1 銀納米顆粒的制備

3種尺寸的銀納米顆粒均從檸檬酸鈉體系、經(jīng)不同的控制還原方法獲得[12-13]。在掃描電鏡下對顆粒粒徑進行統(tǒng)計分析，確認3種樣品尺寸集中分布于20、50和100 nm。獲得后銀納米顆粒經(jīng)離心處理棄掉原溶液中上清，將顆粒溶于少量新生牛血清中，按照血清 ∶DMEM=1∶9的比例加入DMEM培養(yǎng)基，最后樣品采用0.2 μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌。

1.2 細胞培養(yǎng)

U251細胞購自中國科學院上海細胞研究所，置于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。RNaseA、DMSO、MTT和PI購自Sigma公司。

1.3 MTT比色實驗分組

將U251細胞分為銀納米顆粒結合放療組和單純放療組，分為0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 Gy 7個劑量照射組。細胞和銀納米顆粒孵育24 h后接受X射線照射，然后接種至96孔板培養(yǎng)，于48 h后終止培養(yǎng)棄去原細胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μl新鮮配制的含MTT的無血清培養(yǎng)液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min。選擇570 nm波長，在全自動酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(A)，記錄結果。

1.4 克隆形成實驗分組

將U251細胞分為銀納米顆粒結合放療組和單純放療組，分為0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 Gy 7個劑量照射組。細胞和銀納米顆粒孵育24 h后接受X射線照射，然后稀釋至200(0～4 Gy)或2 000(6 Gy)細胞·孔-1接種至6孔板培養(yǎng)14 d后終止培養(yǎng)，固定、染色。

1.5 細胞凋亡檢測

將對數(shù)生長期的U251細胞加入AgNPs，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后照射，再過48 h后收集約105細胞。用PBS洗滌細胞2次。加入Binding Buffer懸浮細胞。加入Annexin VEGFP混勻后，加入Propidium Iodioe，混勻。室溫、避光、反應15 min。1 h內用流式細胞儀檢測熒光強度，并分析數(shù)據(jù)。

1.6 細胞周期檢測

將對數(shù)生長期的U251細胞加入AgNPs，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后照射，再過48 h后收集約105細胞。用PBS洗滌細胞1次后收集。用70%乙醇固定24 h，4 ℃保存。染色前用PBS洗去固定液。加入RNase A 37 ℃水浴30 min。再加入PI(50 μg·ml-1)染色混勻，4 ℃避光30 min。上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

1.7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，組間差異比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3個尺寸的銀納米顆粒的細胞毒性

由于銀納米顆粒能夠在溶液體系中緩釋出銀離子，體系中銀離子的含量取決于銀納米顆粒自身的性質(尺寸和表面包覆等)以及顆粒的濃度。游離的銀離子對細胞存在著毒性，銀納米顆粒則存在對細胞劑量依賴的毒性關系。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)，隨著銀納米顆粒尺寸的增加，IC50值在增大。其中，20 nm的銀顆粒(圖1)在100 μg·ml-1以上顯示出明顯的細胞毒性(圖2)。由于銀納米顆粒對細胞存在劑量依賴的毒性關系，本研究在做放療增敏實驗時均采用IC50值的1/5。在這樣低劑量下，銀納米顆粒對細胞活性影響就很微弱。本研究中采用的銀納米顆粒的劑量是20(20 nm)、45(50 nm)和150 μg·ml-1(100 nm)。

圖1 20 nm的銀納米顆粒SEM圖片

Fig 1 SEM image of 20 nm silver nanoparticles圖2 和20 nm的銀納米顆粒共孵育的U251細胞照片

Fig 2 The photo of U251 cells treated with 20 nm silver nanoparticles2.2 MTT和集落實驗顯示銀納米顆粒降低細胞照射后的存活率 腦膠質瘤細胞和銀納米顆粒共孵育24 h后經(jīng)射線照射處理，然后去除原培養(yǎng)液中的銀納米顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，通過MTT分別檢測各組細胞的活性。結果顯示，20 nm和50 nm的銀納米顆粒結合放療組的細胞活性相對單純放療組有明顯的下降，而100 nm的銀顆粒則無明顯變化。其中，20 nm的銀納米顆粒結合X射線對U251細胞活性的影響如圖3所示。

圖3 MTT結果顯示和20 nm銀納米顆粒共孵育后，經(jīng)照射U251細胞生存率相對單純放療組明顯下降

Fig 3 MTT results showed that the survival rate decreased after U251 cells treated with 20 nm silver nanoparticles and irradiation本研究著重對20 nm的銀顆粒進行進一步的實驗。集落形成實驗是對細胞在放療后增殖能力更精確的驗證實驗。集落實驗顯示，和銀納米顆粒共孵育的細胞在照射射線后生存分數(shù)(集落數(shù)目)相對單純放療組有明顯下降的趨勢(圖4)，這意味著腫瘤細胞經(jīng)銀納米顆粒和X射線共同作用后增殖能力顯著降低。圖4 集落實驗顯示，20 nm銀納米顆粒能夠顯著降低細胞照射后的生存率

Fig 4 The colonyforming assay showed that 20nm silver nanoparticles could significantly decrease cell survival rate after irradiation2.3 流式細胞術顯示銀納米顆粒能夠提高細胞照射后的凋亡率 Annexin VPI檢測進一步表明，銀納米顆粒結合放療組的細胞凋亡率相對單純放療組有顯著提高(圖5)。文獻[14]報道銀納米顆粒能夠引起更多的細胞停止在G2/M期，本研究的結果和其一致。銀納米顆粒誘導了腫瘤細胞進行周期關卡的自檢和修復，而隨后經(jīng)X射線照射作用，更多的細胞進入了凋亡環(huán)節(jié)。

圖5 Annexin VPI檢測結果顯示20 nm銀納米顆粒結合放療能夠顯著提高細胞凋亡率

Fig 5 The Annexin VPI test showed that 20 nm silver nanoparticles could significantly enhance cell apoptosis rate after irradiation

3 討 論

當前納米科學與技術正飛速地向前發(fā)展，并不斷地與各個學科交叉融合，產(chǎn)生出新的研究領域和新的學科生長點，特別是近幾年已越來越多地滲透到醫(yī)學領域，形成了一個快速發(fā)展的新學科。因此，納米科學的發(fā)展為放射增敏劑的研究提供了新的平臺。納米材料與放射增敏關系的研究國內外已有一些文獻報道。如使用PLGA納米材料包裹SR2508(依他硝唑)、多西紫杉醇等對MCF7和HeLa細胞進行放射增敏[15-16]。金納米材料在老鼠結腸癌細胞株和乳腺癌細胞株上均發(fā)現(xiàn)增敏現(xiàn)象[14，17]。

本研究在前人研究的基礎上提出使用銀納米顆粒增強腫瘤放療的作用。銀納米顆粒在體外對細胞的毒性相對同等劑量的銀離子要小很多，在低濃度下對細胞活性的影響微弱。銀納米顆粒對細胞的毒性存在劑量依賴的關系，并且和自身尺寸相關。選取低劑量的銀納米顆粒和腫瘤細胞共孵育，銀納米顆粒能夠進入腫瘤細胞內緩釋出銀離子，從而干擾細胞DNA的復制與修復[11]。受干擾的腫瘤細胞經(jīng)X射線照射后，更多的細胞不再停留于自檢和修復階段，而直接進入凋亡。

本研究通過實驗驗證，20 nm的銀納米顆粒能夠顯著降低腫瘤細胞放療后的存活分數(shù)，50 nm的銀顆粒次之，而100 nm的銀顆粒則無明顯現(xiàn)象。作者認為這可能是20 nm的銀顆粒更容易被細胞吞噬，并且相對其它兩種顆粒在細胞內能夠緩釋出更多的銀離子。

集落形成實驗是衡量細胞在接受射線照射后增殖能力的一個金標準。本研究通過集落實驗驗證U251細胞經(jīng)過和20 nm銀顆粒共孵育后，經(jīng)X射線照射后的存活率相對單純放療組呈明顯下降趨勢。通過流式細胞術的檢測顯示，和20 nm銀顆粒共孵育的細胞照射射線后凋亡率得到進一步提高。

通過對本研究結果的分析可以推測，在不遠的將來，可以進一步開發(fā)出以銀納米顆粒為核心的藥物，從而達到增強放療效果的目的。