作者：趙迪，孫新臣，馬珺，童金龍，徐睿智，張偉，肖韋華

【摘要】 目的：研究多功能納米材料Fe3O4/Ag/C225在體外的穩(wěn)定性、靶向性及抗腫瘤療效。方法:檢測(cè)復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag的釋藥水平;通過MTT比色法初步檢測(cè)Fe3O4/Ag/C225抑制鼻咽癌腫瘤細(xì)胞生長的作用;采用ELISA法檢測(cè)復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225上的C225的穩(wěn)定性。結(jié)果:復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225釋藥緩慢;偶聯(lián)在復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225上C225保持了抗體本身約82%的活性;復(fù)合納米顆粒對(duì)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞抑制作用明顯。結(jié)論:Fe3O4/Ag/C225在體外穩(wěn)定性好，偶聯(lián)C225的復(fù)合納米顆粒保存了抗體活性，對(duì)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞有抑制作用。Fe3O4/Ag/C225有望發(fā)展成為分子影像調(diào)強(qiáng)放療的多功能示蹤劑。

【關(guān)鍵詞】 Fe3O4/Ag/C225; 納米; 鼻咽癌

[Abstract] Objective: To study the stability， targeting and antitumor effect of multifunctional nanoparticles Fe3O4/Ag/C225 in vitro. Methods: The release ratio of Fe3O4/Ag/C225 was tested. Inhibitory effect of Fe3O4/Ag/C225 on nasopharyngeal carcinoma tumor cell growth was detected by MTT assay. The level of preserved antibody activity in the composite nanoparticles coupled C225 was detected by ELISA. Results: Composite nanoparticles released slowly. Experiments showed that composite nanoparticles inhibited tumor cells of nasopharyngeal carcinoma obviously.The C225 antibody coupling the composite nanoparticles Fe3O4/Ag was maintained well. Conclusion: The composite nanoparticles shows the activity inhibition of nasopharyngeal carcinoma in vitro.The composite nanoparticles coupled C225 preserves the activity of antibody well. Fe3O4/Ag/C225 is expected to develop into a multitracer of molecular imaging intensity modulated radiation therapy.

[Key words] Fe3O4/Ag/C225; nanoparticles; nasopharyngeal carcinoma

放射治療是惡性腫瘤的主要治療手段之一，隨著放療設(shè)備、影像技術(shù)等快速發(fā)展，出現(xiàn)了三維調(diào)強(qiáng)適形放射治療(IMRT)[1]。臨床上至今未能有理想經(jīng)影像介導(dǎo)的IMRT的示蹤劑，這也是放射生物學(xué)中亟待解決的問題和當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)研究具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225，該復(fù)合顆粒Fe3O4可以在調(diào)強(qiáng)適形放射治療中示蹤腫瘤，Ag在前期工作中發(fā)現(xiàn)可以作為放射增敏劑，而EGFR單抗C225起到靶向腫瘤的作用。本研究主要探討復(fù)合顆粒Fe3O4/Ag/C225在體外的穩(wěn)定性、靶向性及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，HEPES、胰酶、噻唑藍(lán)(Amersco公司)等均為分析純，DMEM(Gibco Bd公司，美國)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，酶標(biāo)儀(美國BD公司)，CNE(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外釋藥速率 用生理鹽水配成10 g·L-1的混懸液，取10 ml裝于透析袋中，外面透析介質(zhì)亦為生理鹽水，磁力攪拌器常溫?cái)嚢?0 h，每隔1 h取液測(cè)量釋放液中Ag含量，繪制累積釋藥曲線。

1.2.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞株CNE常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長期CNE細(xì)胞，消化吹打成2.5×104 ml-1，在兩塊96孔培養(yǎng)板中每孔接種200 μl(每板兩組，每組8個(gè)復(fù)孔)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h細(xì)胞貼壁后一塊培養(yǎng)板分別加入1640培養(yǎng)液(陰性對(duì)照組)，100、200、400、800μg·ml-1 Fe3O4/Ag/C225， 48h后加入MTT 20 μl， 4 h后棄去液體，每孔加入150 μl DMSO，置于酶標(biāo)儀上振蕩混勻10 min測(cè)OD493 nm值，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè) 取第2代培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞按2×107 L-1 接種于96孔滅菌酶標(biāo)板中，100 μl·孔-1，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h。洗滌4次后晾干，加入4 ℃預(yù)冷的0.25%戊二醇緩沖溶液， 4 ℃固定30 min。每孔加300 μl 1% BSA緩沖溶液，37 ℃封閉1 h，洗滌2次，吸凈殘留液體。稀釋緩沖液將單克隆抗體和Fe3O4/Ag/C225按單克隆抗體量梯度稀釋，每孔加入100 μl，每組設(shè)6個(gè)平行孔。緩沖溶液作陰性對(duì)照， 37 ℃孵育1 h。洗滌2次，加入HRP羊抗鼠Ig (1 ∶2 000 稀釋)100 μl·孔-1，37 ℃孵育1 h。洗滌2次，加入底物液100 μl·孔-1，37 ℃避光反應(yīng)15～20 min，加終止液50 μl。酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm波長處A 值，以C225和Fe3O4/Ag/C225的吸光值對(duì)應(yīng)抗體濃度列表。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)及方差分析作組間均數(shù)比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合納米顆粒結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 體外釋藥速率的動(dòng)態(tài)測(cè)定結(jié)果

以生理鹽水為介質(zhì)考察Fe3O4/Ag/C225復(fù)合納米顆粒中Ag的體外動(dòng)態(tài)釋放，計(jì)算其累積釋放率，48 h釋藥為15.96%(圖2)。

2.3 復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225的抗腫瘤作用

2.3.1 倒置顯微鏡下所見 正常的CNE細(xì)胞呈多邊形多角形，胞質(zhì)伸展，大小一致，細(xì)胞之間相互銜接，排列緊密。細(xì)胞數(shù)量多，貼壁良好，無細(xì)胞破裂及細(xì)胞碎片。光鏡下復(fù)合納米顆粒處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞生長明顯受到抑制，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞已變圓、回縮。當(dāng)濃度達(dá)到800 μg·ml-1時(shí)體外處理組可見大量細(xì)胞變圓、回縮，并從培養(yǎng)瓶壁脫落懸浮于培養(yǎng)基中，說明復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225有明顯的抑制鼻咽癌細(xì)胞的作用(圖3)。

2.3.2 MTT比色法檢測(cè)結(jié)果 Fe3O4/Ag/C225能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE增殖，見表1。

2.4 ELISA法檢測(cè)結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示，復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225中的C225的活性保存良好(表2、圖4)。

3 討 論

放射治療是惡性腫瘤的主要治療手段之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)約70%的腫瘤患者在治療的不同時(shí)期需要進(jìn)行放射治療[2]。IGRT是一種精確放療技術(shù)，靶區(qū)內(nèi)各點(diǎn)的劑量能按設(shè)定的要求進(jìn)行調(diào)整，達(dá)到靶區(qū)內(nèi)腫瘤體積的劑量最優(yōu)化。因此IGRT減少了周圍正常組織的受照射劑量，是當(dāng)前放療領(lǐng)域在三維上考慮腫瘤形狀、密度并考慮時(shí)間因子的先進(jìn)技術(shù)。但臨床上至今未能有理想的示蹤劑顯示腫瘤的微浸潤病灶，成為該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。當(dāng)前廣泛研究的示蹤劑在分辨力、敏感性、特異性及安全性方面都存在或多或少的缺陷。如放射性核素顯像方法可以用來評(píng)價(jià)移植細(xì)胞的活性功能，敏感性極高，但空間分辨率太低，且其安全性還遠(yuǎn)未得到深入評(píng)估。熒光成像技術(shù)，其背景干凈，敏感性極高，但其只能用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究、空間分辨力差、解剖細(xì)節(jié)對(duì)應(yīng)關(guān)系不強(qiáng)、光線探測(cè)深度較淺等缺陷，注定了其臨床應(yīng)用價(jià)值有限[3-7]。

Fe3O4/Ag / C225 多功能復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225是我們課題組前期成功制備的，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗腫瘤制劑。超順磁Fe3O4納米顆粒[8]具有在磁共振下成像的特性， C225既具有抑制腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)，同時(shí)又具有放射增敏效應(yīng)。我們課題組前期研究證明納米Ag顆?？梢栽黾臃派渚€對(duì)腫瘤細(xì)胞殺滅作用，有可能成為腫瘤放射治療的增敏劑[9]。應(yīng)用復(fù)合納米顆粒中的Fe3O4做為磁共振下成像的顯像劑，可能為體內(nèi)調(diào)強(qiáng)放射治療提供腫瘤細(xì)胞的示蹤圖像。實(shí)驗(yàn)中我們首先證實(shí)了這種新型材料具有良好的釋控性，穩(wěn)定性好。MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)e3O4/Ag/C225對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE增殖具有良好的抑制性。為了驗(yàn)證當(dāng)EGFR單抗鏈接在Fe3O4/Ag上時(shí)是否很好地保持了抗體的活性，我們通過ELISA法檢測(cè)了復(fù)合顆粒Fe3O4/Ag/C225中C225的活性，結(jié)果顯示抗體活性保存良好。

通過本研究，在已構(gòu)建的基于生物納米磁性材料的示蹤、增敏、抗腫瘤多功能平臺(tái)上，從分子影像學(xué)、腫瘤分子靶向治療的角度探討復(fù)合納米顆粒Fe3O4/Ag/C225在體外蛋白及基因水平上的作用機(jī)制、在體內(nèi)的療效及可能的作用機(jī)制，為分子影像引導(dǎo)的調(diào)強(qiáng)放射治療提供一個(gè)無創(chuàng)動(dòng)態(tài)的研究手段。