【摘要】 納米磁性材料的生物相容性檢測是其應(yīng)用于腫瘤熱療技術(shù)的前提之一。納米磁性材料能否用于人體，必須考察其是否具有良好的生物相容性。生物相容性一般包括細(xì)胞相容性、組織相容性和血液相容性3個方面。作者就生物相容性的概念、生物相容性的3個方面及生物相容性評價工作中存在的問題對腫瘤熱療用納米磁性材料生物相容性評價方法的新進展進行綜述。

【關(guān)鍵詞】 納米磁性材料; 生物相容性; 評價方法; 文獻綜述

隨著人們生活水平的不斷提高，惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的勁敵。各種報道和調(diào)查顯示[1]，全世界每年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤患者多達1 090萬，而且腫瘤的發(fā)病率持續(xù)上升，成為僅次于心血管疾病的第二大致死原因。但是，目前臨床上對腫瘤的治療手段仍然十分有限，預(yù)后也比較差。腫瘤磁感應(yīng)熱療[2-5]是一種新型的腫瘤治療手段，它通過各種方法將納米磁性材料精確地分布于腫瘤組織中，在外加交變磁場的作用下，納米材料感應(yīng)發(fā)熱，使腫瘤組織達到一定的溫度，從而達到治療腫瘤的效果。有研究表明[6]，腫瘤細(xì)胞在高溫的環(huán)境下對放射線更為敏感。研究發(fā)現(xiàn)[7]，越小的納米顆粒越有可能穿透細(xì)胞并產(chǎn)生毒性作用。所以，納米磁性材料能否用于人體，首先必須考察其是否具有良好的生物相容性。

生物相容性一般包括細(xì)胞相容性、血液相容性和組織相容性3個方面。下面就生物相容性的概念、生物相容性的3個方面及生物相容性評價工作中存在問題的研究進展作一綜述。

1 生物相容性的概念

相容性[8]是指兩種或兩種以上的體系共存時互相之間的影響。如果這些體系在共存時互不影響，互不損傷，互不破壞，就可以說這些體系間有完全的相容性。如果這些體系在共存時相互影響，相互破壞，導(dǎo)致不能長期共存時，就可以說這些體系之間的相容性差或沒有相容性。生物相容性[9]是指任何一種外源性物質(zhì)，包括天然材料[10]、治療用的外源性細(xì)胞、植入的器官、人工材料的植入體或納米粒子，為治療目的植入或通過某種方式進入生物體，或與生物組織共存時，對生物體和生物組織造成損傷，或引起生物體、生物組織發(fā)生反應(yīng)的能力和性質(zhì)，和(或)生物體容許這種材料在體內(nèi)存在及與這種材料的相互作用的能力和性質(zhì)。普遍認(rèn)為生物相容性包括兩大原則[11]：一是生物安全性原則即消除生物材料對人體的破壞性;二是生物功能性原則(或稱為機體功能的促進作用)，指其在特殊應(yīng)用中“能夠激發(fā)宿主恰當(dāng)?shù)貞?yīng)答”的能力。納米材料對于宿主是異物，在體內(nèi)必定會產(chǎn)生某種應(yīng)答或出現(xiàn)排異現(xiàn)象。納米材料要使發(fā)生的反應(yīng)能被宿主接受，不產(chǎn)生有害的作用，因此要對納米材料進行生物安全性評價，即生物學(xué)評價。對納米磁性材料進行生物相容性評價是納米磁性材料能否進入臨床研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。

2 細(xì)胞相容性評價

細(xì)胞相容性[13]是材料對細(xì)胞的生長、附著、增殖及代謝功能的影響，以存活的有功能的細(xì)胞或(和)細(xì)胞生長增殖情況作為材料的生物相容性評價指標(biāo)。常用的細(xì)胞相容性評價實驗方法有 MTT試驗、流式細(xì)胞光度術(shù)等。一般選用L929細(xì)胞和HeLa細(xì)胞來進行試驗，這兩種細(xì)胞[14]具有傳代容易、繁殖迅速、體外培養(yǎng)條件低、易儲存，同時這兩種已建立成系的細(xì)胞株能為實驗提供穩(wěn)定傳代的細(xì)胞、能為許多材料細(xì)胞毒性評價所共用等優(yōu)點，1982年美國質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會將L929細(xì)胞推薦為細(xì)胞毒性試驗中的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞。

2.1 MTT試驗

MTT試驗是大部分磁性介質(zhì)生物相容性評價工作采用的基本試驗項目。它是一種比較準(zhǔn)確、快速和簡便、可作定量評價的常用方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)用材料的生物學(xué)評價。其原理是活細(xì)胞中的線粒體脫氫酶將MTT分子還原產(chǎn)生紫色結(jié)晶物，紫色結(jié)晶物形成數(shù)目的多寡與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)呈正相關(guān)，用DMSO溶解結(jié)晶后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測吸光度，即可代表細(xì)胞數(shù)量。將測得的吸光度帶入細(xì)胞相對增殖率的公式來計算。細(xì)胞相對增殖率(RGR)= 實驗組OD均值/陰性對照組OD均值×100%。把RGR值轉(zhuǎn)換成6級反應(yīng)[15]：0級反應(yīng)RGR值為≥100%，1級反應(yīng)RGR值為75%～99%，2級反應(yīng)RGR值為50%～74%，3級反應(yīng)RGR值為25%～49%，4級反應(yīng)RGR值為1%～24%，5級反應(yīng)RGR值為0。實驗結(jié)果是0或 1級反應(yīng)為合格，實驗結(jié)果是2級反應(yīng)需要結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評價，實驗結(jié)果是3～5級反應(yīng)為不合格。

目前已進行過細(xì)胞學(xué)評價的納米磁性材料有納米Fe2O[15]3、納米Fe3O[16]4、納米鎳銅熱籽[17]、納米Mn0.5Zn0.5Fe2O[18]4等。例如顏士巖等[15]研究指出，不同濃度的Fe2O3納米磁性粒子浸提液作用于L929細(xì)胞72 h 后，其細(xì)胞RGR分別為91.3%、76.9%、76.6%、81.9%，依相對增殖率與毒性分級轉(zhuǎn)換表標(biāo)準(zhǔn)判定不同濃度的Fe2O3納米磁性粒子浸提液其細(xì)胞毒性均為1級，均屬對細(xì)胞無毒性范疇，而陽性對照組0.7%的丙烯酰胺單體溶液的細(xì)胞RGR為11.6%，其毒性評定為4級，為不合格生物材料，證實其自制的F2O3納米磁性粒子體外試驗無細(xì)胞毒性作用。該法簡便迅速、不接觸同位素、敏感性高，缺點是紫色結(jié)晶物有時易聚集成團影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[19]。

2.2 流式細(xì)胞光度術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)[20]

該法利用鞘流原理，使被熒光標(biāo)記的單個懸浮細(xì)胞排成單列，按重力方向流動。細(xì)胞被激光照射后發(fā)射熒光，檢測器可逐個對細(xì)胞的熒光強度進行測定，常用來檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。鄧凌燕[21]研究發(fā)現(xiàn)，隨著Fe3O4磁微粒浸提液干預(yù)濃度的增高，肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率無增高的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。證實不同濃度Fe3O4磁微粒浸提液對肺泡上皮細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無影響。FCM法能提供具體明確的凋亡率值，為評價凋亡提供客觀的數(shù)值指標(biāo)，同時可為分析材料對細(xì)胞周期的影響提供證據(jù)。

2.3 乳酸脫氫酶(LDH)試驗[22]

LDH定位于細(xì)胞胞漿內(nèi)。一般情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞受損傷或死亡時可釋放到細(xì)胞外，此時細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性與細(xì)胞死亡數(shù)目成正比。這一方法已被用來檢測碳納米管的細(xì)胞毒性[23-24]。王曉娜等[25]發(fā)現(xiàn)，隨著Fe2O3納米顆粒作用濃度的升高(267.5、535、1 070 μg·ml-1)，可致細(xì)胞內(nèi)LDH漏出量增加。此法通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH的活性，可判斷細(xì)胞受損的程度。

2.4 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測細(xì)胞DNA損傷

單細(xì)胞凝膠電泳又稱彗星實驗，由Singh等[26]和Ostling等[27]在中性凝膠電泳技術(shù)基礎(chǔ)上改進和建立，是檢測單個細(xì)胞DNA鏈斷裂的實驗方法，該方法具有靈敏、簡便、快速、樣品用量少及不需放射性等優(yōu)點。李倩等[28]運用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，納米Fe2O3可造成小鼠肝、脾、腎組織細(xì)胞、外周血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的DNA斷裂，其研究表明DNA斷裂與細(xì)胞的氧化損傷有密切關(guān)系。Lacava等[29]發(fā)現(xiàn)，磁流體還可以致小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)氧自由基和氧化亞氮的生成，從而造成DNA損傷。

除此之外，還有一些研究者進行過其他相關(guān)實驗，如體外CHI細(xì)胞染色體畸變試驗[30]DNA合成檢測方法、細(xì)胞膜完整性測定、人工計算細(xì)胞數(shù)[1]等細(xì)胞相容性試驗。

3 血液相容性評價

血液相容性試驗[31]通過生物材料和醫(yī)療器械與血液相接觸(體外、半體內(nèi)或體內(nèi))，評價其對血栓形成、血漿蛋白、血液有形成分和補體系統(tǒng)的作用。通過對材料與血細(xì)胞體外接觸過程中所致紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離程度的測定，對材料的體外溶血進行評價，能敏感地反映試樣對紅細(xì)胞的影響，在生物安全性評價中起重要作用。

體外溶血試驗是鑒定血液相容性最基本方法之一[32]，它不僅可以評價樣品的體外溶血性，還可以敏感地提示樣品的毒性。Zhang等[33]通過體外溶血試驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4納米磁性粒子的溶血率為0.514%，遠(yuǎn)小于5%，表明實驗用Fe3O4納米磁性粒子無溶血作用，符合醫(yī)用材料的溶血試驗要求。Zhang等[34]研究發(fā)現(xiàn)MgZnMn合金的溶血率高達65.75%。Li[35]研究發(fā)現(xiàn)單純的鎂溶血率是59.3%。因此說溶血試驗在生物安全性評價中起著重要的作用。

由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性及多變性和血凝機理，ISO標(biāo)準(zhǔn)中也只能提出一個評價方向的基本要求，到目前為止還沒有建立一套相關(guān)的評價標(biāo)準(zhǔn)。新近研究建立的新方法[36]有血小板黏附及血小板消耗量、復(fù)鈣時間、凝血因子Ⅳ、血漿總蛋白和球蛋白計數(shù)等諸多方面的血液相容性試驗方法，但對納米磁性材料進行定量化的評價有一定的難度，需要不斷成熟和完善，將其標(biāo)準(zhǔn)化。

4 組織相容性評價

組織相容性[37]是指生物材料與人體組織接觸后，在材料組織界面發(fā)生一系列相互作用，最終被人體組織所接受的性能。常用的組織相容性試驗有體內(nèi)植入試驗、微核試驗、肝臟穿刺試驗等。

4.1 體內(nèi)植入試驗

植入試驗[31]將生物材料和醫(yī)療器械植入動物的合適部位，如皮下、肌肉和骨，在觀察一定時期(短期為7、15、30、60、90 d，長期為180、360或720 d)后，評價對活體組織局部毒性作用。主要通過病理切片觀察組織的變化。根據(jù)產(chǎn)品使用部位可選擇皮下組織植入試驗、肌肉植入試驗或骨內(nèi)植入試驗。體內(nèi)植入試驗可從宏觀和微觀水平來評價組織工程支架材料對組織的局部反應(yīng)，包括早期的炎癥反應(yīng)和隨后的纖維結(jié)締組織增生反應(yīng)。通過體內(nèi)埋植實驗可以直接觀察動物機體對材料中的抗原或化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答[38-39]。材料植入機體后[40]被視為異物，在無其他因素影響的情況下，如材料有毒性，會導(dǎo)致其周圍組織死亡;如材料無毒性，機體組織對植入物的反應(yīng)主要是無菌性炎癥反應(yīng)和纖維結(jié)締組織包膜產(chǎn)生。組織反應(yīng)在早期呈現(xiàn)異物刺激引起輕中度的無菌性急性炎癥反應(yīng)比如水腫、組織充血和中性粒細(xì)胞的浸潤等等，兩周后轉(zhuǎn)為慢性炎癥反應(yīng)包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和纖維母細(xì)胞的增生。機體通過吞噬和酶消化方法消除異物，或者通過纖維囊的包裹隔離材料。材料中任何成分分解產(chǎn)生的小分子都會影響炎癥反應(yīng)的過程。白雪[17]研究發(fā)現(xiàn)，其自制的鍍金鎳銅熱籽植入肌肉后，植入后的局部組織無明顯的毒性及刺激作用，組織相容性較好。 Fulzele等[41]研究發(fā)現(xiàn)甘油酯(GMR)和季戊四醇酯(PMR)植入局部組織無明顯的炎癥反應(yīng)。

4.2 微核試驗

微核試驗是一種檢測材料致畸致突變作用的方法，能夠簡便、快速地檢測樣品的短期遺傳毒性。間隔24 h給藥2次，首次給藥后第30小時處死小鼠，常規(guī)制片。每只動物計數(shù)1 000個嗜多染紅細(xì)胞，計算微核率。Zhang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，其制備的熱敏磁性復(fù)合納米粒通過檢測各組嗜多染紅細(xì)胞中的微核(MN)出現(xiàn)率，未發(fā)現(xiàn)復(fù)合納米粒組與陰性對照組間有顯著性差異，認(rèn)為該復(fù)合納米粒無致畸或致突變作用。

4.3 肝臟穿刺試驗

肝臟穿刺試驗是將磁性材料置入組織器官一段時間后，觀察材料對創(chuàng)傷性組織炎癥防御性反應(yīng)和主要代謝器官、血液系統(tǒng)的功能影響的一種方法。方法: 在無菌條件下，用3%戊巴比妥鈉麻醉后在超聲導(dǎo)向定位下肝臟穿刺注入0.9%生理鹽水和納米粒懸液，1個月后處死，取心、肝、脾、肺、腎等進行病理形態(tài)觀察.實驗前后試驗動物靜脈采血作血常規(guī)及肝腎功能檢查。叢小明等[18]研究發(fā)現(xiàn)，沿穿刺方向切開肝臟，見黑色材料浸潤在注射路徑周圍，材料和周圍肝組織邊界清晰，無瘀血及炎癥改變，在材料分布區(qū)，部分材料微粒被肝細(xì)胞吞噬，肝小葉結(jié)構(gòu)完整無變形以及纖維化，心肝脾肺腎腦等臟器未見明顯組織形態(tài)學(xué)變化。血常規(guī)、肝腎功能無明顯變化，證明其自制的納米材料具有良好的組織相容性，適宜應(yīng)用于肝內(nèi)局部注射治療腫瘤。

5 生物相容性評價工作中存在的問題

近年來，多種納米磁性材料的生物相容性接受了不同程度的評價研究，有了更多新的試驗方法和檢測指標(biāo)，使生物相容性研究不斷深入。但是，其中仍然存在一定的問題，首先是存在純度的問題，目前進行實驗的材料往往混有其他雜質(zhì)， 在使用高純材料進行實驗之前，這些雜質(zhì)所起到的作用是無法排除的。其次，存在粒度均勻性問題，目前進行實驗的材料，粒度分布很寬，從幾個納米到幾百納米的顆粒都存在，不同粒徑的性質(zhì)無法檢驗出來，目前的實驗結(jié)果到底是小顆粒作用的結(jié)果，還是大顆粒的結(jié)果，有待于粒徑均勻顆粒實驗結(jié)果的證明[43]。再次，很多研究[44-47]報道納米顆粒在介質(zhì)(如水、細(xì)胞培養(yǎng)液)中會發(fā)生團聚的現(xiàn)象，發(fā)生團聚后，納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)可能會發(fā)生改變，從而影響其生物學(xué)效應(yīng)。納米顆粒在細(xì)胞培養(yǎng)液中的溶解度對其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響，也是需要特殊考慮的[48-49]。最后，目前所有的評價，都沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)的方法，不同方法之間的結(jié)果不具有可比性。這些都需要科研工作者在以后的實驗中不斷深入探索和研究。