【摘要】 目的： 研究納米雄黃脂質體的制備方法并對其特性進行檢測。方法： 采用化學沉淀法先制備納米級雄黃，薄膜分散高壓均質法制備納米雄黃脂質體。用電子顯微鏡、能譜儀、原子熒光光譜儀、激光粒度分析儀對其進行特性研究，并研究其體外抗腫瘤細胞的能力。結果： 薄膜分散高壓均質法制備的雄黃納米脂質體平均粒徑為102.3 nm，分散性良好，球形或卵球形。能譜儀證實其中含有砷和硫的成分，脂質體的藥物包封率為82.78%。體外作用于HepG2肝癌細胞顯示其有良好的抑制生長作用。結論： 采用上述方法可以成功制備納米級別的雄黃脂質體，粒徑較小，符合納米制劑的要求，穩定性良好，藥物包封率高，并且具備良好的抗腫瘤細胞的作用。納米雄黃脂質體是一種新型納米級劑型，為傳統中藥在抗腫瘤方面的應用提供了新的思路。

【關鍵詞】 納米脂質體； 雄黃； 特性; 抗腫瘤作用

近年來，我國學者將主要成分為三氧化二砷（As2O3）的中藥砒霜用于治療急性早幼粒細胞白血病，效果良好，從而引起了人們從腫瘤治療學角度研究砷劑的極大興趣。雄黃與砒霜同屬于含砷礦物類中藥，其主要成分為As2S2和As4S4，并夾雜少量As2O3和其他重金屬鹽。傳統醫學認為，雄黃具有解毒、燥濕、祛痰、截瘧等作用;現代醫學研究表明，雄黃還具有抗腫瘤作用。以往的研究證實其對慢性粒細胞白血病、骨髓增生異常綜合征等惡性血液系統疾病療效顯著。與砒霜相比，雄黃含砷量低，毒性相對較小，所以有很廣闊的應用前景［1］。但目前雄黃采用傳統中藥制劑工藝使其入藥非常困難，需經研磨、水飛等繁復的工藝手段，存在耗時、廢料、毒性大、顆粒偏大、生物利用度較低等缺點，因此我們在看到雄黃臨床應用價值的同時，通過制備藥物新劑型，以減少用藥量、提高療效，具有非常重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

雄黃（南京藥材公司），天然大豆磷脂（Lipoid，德國），膽固醇（北京奧博星生物技術責任有限公司），維生素E（Sigma，美國），明膠（AMRESCO，美國），其余均為化學純。H600透射電子顯微鏡(Hitachi，日本)，能譜儀(Thermo NORAN Vantag，美國)，旋轉蒸發器（河南鞏義英裕子華儀器廠），超聲波清洗器（上海超聲波儀器廠），ZETA SIZER 3000激光粒度分析儀（MALVERN，英國），高壓均質機（Avestin，加拿大）。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米雄黃脂質體的制備 將雄黃原粉粉碎后用2 mol·L-1的鹽酸40 ℃浸泡2 h并不斷攪拌，用蒸餾水沖洗至中性，過濾。用濃鹽酸浸泡24 h，蒸餾水沖洗至中性，過濾，棄濾液，得到去除雜質元素的雄黃粉末。將上述預處理后的雄黃粉末加入Na2S溶液，磁力攪拌，使充分反應。去離子水反復沖洗，過濾，棄渣，緩慢滴加 0.2 mol·L-1的鹽酸，并不斷攪拌，將最后生成的納米雄黃4 ℃避光保存。

納米雄黃脂質體采用薄膜分散高壓均質法制備，將配方量天然大豆磷脂、膽固醇、維生素E置于圓底燒瓶中，加入適量無水乙醚充分溶解，超聲2 min，置旋轉蒸發器減壓蒸發至有機溶劑完全揮發，在瓶壁形成一薄膜。取前面制備的納米雄黃溶于明膠PBS液中，加入圓底燒瓶中，高速攪拌30 min，使薄膜完全脫落。加入甘油后置-20 ℃冰箱，2 h后取出37 ℃凍融，超聲10 s后繼續置-20 ℃，反復處理兩次后，在高壓均質機60～70 MPa壓力下均質處理3～4次，4 ℃條件下保存。

1.2.2 納米雄黃脂質體的表征 將制備的納米雄黃脂質體滴有膜銅網，透射電鏡下觀察其形貌及大小。掃描電鏡視野下任意選幾個納米顆粒，用能譜儀對其成分進行分析，驗證雄黃納米脂質體已成功制備。另取適量納米雄黃脂質體，用緩沖液稀釋后，用ZETA SIZER 3000 激光粒度分析儀進行粒徑測定，應用動態光散射軟件進行數據處理，記錄平均粒徑、多分散性指數。

納米雄黃脂質體包封率測定：取1 ml雄黃脂質體，置于eppendorf管中，12 000 r·min－1離心5 min，收取離心液，用原子熒光光譜儀測定離心液及洗滌液中砷的含量。按中國藥典2000年版脂質體包封率的計算公式計算包封率，即包封率 = (W總- W游)/W總×100%。W總為投入總藥物量，W游為未包入脂質體的游離藥物量。

納米雄黃脂質體的穩定性考察：將雄黃脂質體在室溫下靜置兩個月后，進行肉眼和電子顯微鏡下觀察。

1.2.3 雄黃納米脂質體體外抗肝癌細胞的實驗 HepG2細胞培養于含10%小牛血清、100 U·ml－1青霉素和100 μg·ml－1鏈霉素的RPMI 1640培養液中，在37 ℃、飽和濕度及5％CO2的細胞培養箱內傳代培養。取對數生長期細胞用0.25%胰酶、RPMI 1640中止消化，吹打成單細胞懸液，計數，用培養液調成細胞濃度為6×104 ml－1，將細胞接種到96孔培養板中，100 μl·孔－1，置于37 ℃、5％CO2 培養箱中培養24 h。實驗組用RPMI 1640培養液將納米雄黃脂質體稀釋成雄黃濃度分別為5和10 mg·L-1，對照組加入RPMI 1640培養液，繼續培養24和48 h。每孔加MTT液20 μl (5 mg·L-1，PBS配制)，繼續培養4 h后吸盡上清液，加二甲基亞砜（DMSO）每孔150 μl，振蕩溶解10 min。用酶標儀在492 nm下測OD值。根據公式“細胞的存活率（％）＝各實驗組OD值/對照組OD值×100％”計算細胞存活率。用倒置顯微鏡觀察細胞形態，拍照。 2 結果

2.1 形態觀察

天然雄黃外觀呈土狀塊或石塊狀；制備的納米雄黃為淡黃色液體狀；納米雄黃脂質體為淡黃色乳狀液，分散良好，久置不分層。

透射電鏡下觀察發現，傳統的雄黃粉末呈方形、多邊形或不規則晶體狀，直徑較大，在5 μm左右甚至更大（圖1）。 納米雄黃脂質體近似球形，分散性良好，粒徑分布在100～500 nm。經高壓均質處理后，雄黃脂質體粒徑大小均勻一致，大部分在100 nm左右（圖2）。

2.2 納米雄黃脂質體激光粒度分析儀測定粒徑

ZETA SIZER 3000 激光粒度分析儀測定結果顯示：未經高壓均質處理的雄黃脂質體平均粒徑在300 nm左右，且粒徑大小分布不均勻；高壓均質后雄黃脂質體平均粒徑102.3 nm，單峰狀，多分散指數為0.479，說明粒徑分布范圍窄，均勻一致（圖3）。

2.3 能譜分析

在JEM2010掃描電鏡下對單個納米顆粒進行EDS分析，結果顯示納米雄黃脂質體含有砷和硫的成分，表明納米雄黃脂質體已制備成功（圖4）。

2.4 納米雄黃脂質體的藥物包封率的測定

用原子熒光光譜儀測定的納米雄黃脂質體中砷含量為0.649 mg·ml-1，總投入量為0.784 mg·ml-1，雄黃的包封率為82.78%。圖3 高壓均質后的納米雄黃脂質體激光粒度分析儀結果

2.5 雄黃脂質體的穩定性考察

納米雄黃脂質體室溫下靜置兩個月后無絮化、分層和沉淀，電鏡觀察有輕度的融合現象。

2.6 納米雄黃脂質體體外抗肝癌細胞的實驗

倒置顯微鏡下：正常的HepG2細胞呈多邊形多角形，胞質伸展，大小一致，細胞之間相互銜接，排列緊密。細胞數量多，貼壁良好，無細胞破裂及細胞碎片。5 mg·ml-1的納米雄黃脂質體處理細胞48 h后，細胞生長明顯受到抑制，細胞明顯數量減少，部分細胞已變圓、回縮。10 mg·ml-1的納米雄黃脂質體處理組可見大量細胞變圓、回縮，并從培養瓶壁脫落懸浮于培養基中，說明納米雄黃脂質體有明顯的抗肝癌細胞的作用（圖5）。MTT檢測細胞存活率（圖6）顯示：雄黃濃度為5 mg·ml-1的脂質體液處理細胞24 h后，細胞增殖率為74.375%，48 h后降到55.375％；濃度為10 mg·ml-1的脂質體組細胞的增殖率分別為57.25%和32.38%。

3 討論

中醫藥是祖國悠久歷史文化的瑰寶，為中華民族的繁衍生息作出了不朽的貢獻。砷制劑是中醫藥“以毒攻毒”的代表藥物之一，其對腫瘤的治療一直是近年來的研究熱點，特別是對白血病的治療為人們所關注。雄黃屬于含砷礦物類中藥，主要是As4S4和As2S2，常與雌黃共生，又稱雞冠石、黃金石等。研究證實，雄黃對慢性粒細胞白血病、骨髓增生異常綜合征等惡性血液系統疾病療效顯著。但很多中醫藥往往由于生產工藝落后，不能大規模生產，無法滿足臨床需求。雄黃現常采用水飛法制備，但水飛法耗時、耗水、耗電，不適宜大規模生產，制得的顆粒較大，不或難溶于水，故劑型單一，生物利用度也低。隨著納米醫藥技術的不斷發展，將傳統中藥制備成納米制劑已成為近年來的研究熱點。作者在前期做了大量此方面的研究工作，已將傳統的As2O3制成了納米級的多種劑型，進行了體內外實驗研究，證實其有良好的抗腫瘤效果及應用范圍［25］。本研究中，我們將雄黃制備成了納米脂質體，并對其進行了表征。

納米級別的雄黃在以往的文獻中有報道，制備方法常見的有氣流粉碎法、細珠研磨法、微射流法、高能球磨法等，這些物理方法制備納米雄黃往往對設備要求高，并且由于水溶性差，只能采用口服和外用的劑型［67］。脂質體是一種類似超微膠囊的新劑型，是將藥物包封于類脂(磷脂與膽固醇)雙分子層形成的薄膜制成的微型球狀體。由于脂質體具備類細胞結構，可以穩定吸附到癌細胞表面，通過融合、內吞、脂交換等作用導致藥物釋放，從而使藥物在局部到達較高濃度。這種特點能顯著提高藥物的生物利用度，降低毒副作用。將脂質體技術有效應用到中藥生產中，將對我國的傳統中藥產生積極的影響。目前，用脂質體包裹抗癌藥物的研究較多，常被包裹的藥物有阿霉素、環磷酰胺、甲氨蝶呤及紫杉醇等等，而傳統中藥雄黃的脂質體研究國內外還未見報道。本實驗小組前期在脂質體制備技術方面做了大量研究工作，經過技術改良，成功制備出As2O3脂質體，體內外實驗顯示其有良好的抗腫瘤作用［89］。本實驗中，我們

近年來，國內外學者在砷劑抗癌研究方面取得了可喜的成就，大量的臨床實踐和基礎研究已證明含砷類中藥在腫瘤治療方面有廣闊的應用前景。雄黃的抗癌作用機制復雜、廣泛而特異，最終目的為抑制增殖、誘導凋亡或促進分化。本實驗中，我們將制備的納米雄黃脂質體對人肝癌HepG2細胞進行了體外實驗，結果顯示其有較強的生長抑制作用，且呈明顯的時間劑量效應。

本實驗制備了納米雄黃脂質體，制備方法簡單、易行，為納米級雄黃進一步的體內外實驗研究奠定了基礎，也為傳統中藥在抗腫瘤納米醫藥的發展上提供了新的思路和方法。