作者：徐遠義 黃允寧 馬竟先

【摘要】 ［目的］ 探討胃癌細胞粘附過程中的形態學變化以及與整合素β1表達的關系。［方法］ 借助位相差顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對胃癌MKN1活體細胞的粘附過程和整合素β1的表達部位和程度進行觀察。［結果］ 細胞通過伸出偽足附著在培養盤上，整合素β1在細胞膜和細胞偽足部分的表達增強，并形成集落團塊。［結論］ 人胃癌MKN1細胞的粘附過程和整合素β1的表達有直接關系。

【關鍵詞】 胃腫瘤 粘附 整合素β1

粘附是腫瘤細胞轉移的一個基本過程。整合素是一個質膜糖蛋白的家族，由非共價結合的雜合二聚體組成，參與細胞—間質及細胞—細胞間粘附作用，包括胚胎發育、止血、血栓形成、創傷愈合、免疫性及非免疫性防御機制和致癌的轉化作用等。整合素β1與腫瘤浸潤有關。本實驗使用共聚焦顯微鏡對胃癌MKN1細胞的粘附過程進行了觀察，同時對整合素β1在粘附過程中的作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胃癌MKN1細胞株購自日本癌研究資源庫。細胞保存在含有10%小牛血清(FBS)的RPMI?鄄1640培養液中，在37℃，5%CO2的條件下培養。使用FITC標記的抗整合素β1抗體。

1.2 方 法

位相差顯微鏡觀察：將MKN1細胞(5×104細胞/孔) 培養于4孔培養盤中30min后用位相差顯微鏡觀察細胞的形態。

細胞整合素β1的熒光免疫染色：將MKN1細胞培養于含有FITC標記的抗整合素β1抗體（1/50）的0.2% 牛血清蛋白（BSA）/PBA中90min。用PBS洗3次后，將細胞置于共聚焦顯微鏡觀察盒中，用含有10%FBS的培養液培養，在37℃，5%CO2條件下進行觀察（激發波長488nm，發射波長515nm）。

2 結 果

2.1 胃癌MKN1細胞形態變化

胃癌MKN1細胞是貼壁生長細胞，在置入培養盤后很快附著在培養盤壁上，并粘附于培養盤上。細胞首先發生形態變化，由圓形變成橢圓形，同時伸出偽足與培養盤壁相接，使細胞穩定地粘附于培養盤壁上。細胞繼續伸展成扁平狀，并通過偽足與其它細胞接觸形成單細胞層，這種結構可以使細胞穩定附著于培養盤上。培養30mim后位相差顯微鏡下即可觀察到細胞與培養盤粘附；4h后可觀察到細胞伸展呈扁平狀，表面形成偽足，細胞偽足間相互連接，使細胞穩定附著于培養盤上。

2.2 整合素β1

整合素β1為跨膜蛋白，在細胞膜上表達。培養5min后即可觀察到細胞表面形成毛刺狀偽足(圖1箭頭所示)，在細胞膜上可觀察到較弱的熒光信號，即整合素β1有微弱表達。培養2h后細胞變形并形成偽足，在細胞底面的細胞膜上和毛刺狀偽足上可以觀察到較強的熒光信號，表明整合素β1向細胞底面和細胞偽足聚集。培養4h后，細胞底面形成巨大偽足，在細胞偽足上可觀察到強烈的熒光信號，整合素β1形成許多巨大的集落團塊見圖2。

3 討 論

整合素是一種膜鑲嵌糖蛋白，由18ix和813兩個亞單位非共價形成異二聚體復合物。亞單位的變異使整合素形成一個龐大的家族，有的參與不同細胞之間的粘附連接，有的協助細胞和細胞外基質的結合。整合素通過胞外區與配體細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)結合，如纖黏連蛋白(fibronectin，FN)，玻黏蛋白(vitronectin，VN)等，個別的還能與可溶性的配體如纖維蛋白原(fibrinogen)和一些細胞表面分子結合，從而介導細胞與ECM 以及細胞與細胞之間的粘附[1]。它通過胞內區與細胞內的骨架蛋白、肌動蛋白、輔肌動蛋白、踝蛋白、紐蛋白等相互作用[3]。細胞經整合素介導與ECM粘附并在其上鋪展，整合素在粘附面的分布呈斑點存在，細胞骨架蛋白以斑點為中心集中，在細胞膜的胞質面形成黏附斑[2]。由此，整合素將細胞外基質與細胞內骨架蛋白連接在一起，介導細胞與細胞及細胞與細胞外基質的粘附，維持細胞的形態，影響細胞的粘附、運動、吞噬等作用[3]。

腫瘤轉移是一個復雜的多步驟多環節的過程，在腫瘤轉移過程中發生許多腫瘤細胞和ECM的相互作用，整合素在此過程中發揮主要作用。當癌細胞發生轉移時，它們與ECM的親和力發生改變，這種表型改變通過細胞表面黏附分子整合素的改變、蛋白酶釋放使ECM重塑及新的ECM分子沉積來調節[4]。這些激活的信號級聯調節基因的表達、細胞骨架的形成、細胞粘附和細胞存活，結果使癌細胞更具侵襲性，在不同微環境中更好地生存[5]。在轉移過程中，癌細胞伸出扁平偽足與ECM粘附，同時使ECM分子之間的聯系消失，從而使癌細胞前行。

本研究通過光學顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察到MKN1細胞移動時首先伸出偽足，然后細胞變形成為扁平狀，細胞與細胞之間以偽足相連接，細胞通過其形態改變以及與其它細胞間的連接達到穩定狀態，從而牢固地附著于培養盤上。偽足的作用如同探測器，與周圍細胞或細胞外間質接觸后引導細胞著陸[6]。一些關于整合素集落的形成和轉移的研究表明，在細胞活動中，活性化的整合素通過局部聚集的方式從細胞的后緣（尾部）轉移到細胞的前方（頭部），并在此與細胞外結構形成粘附接觸，引發細胞局部粘附的形成[7]。整合素是位于細胞膜上的跨膜蛋白，當整合素細胞外結構與細胞外間質、糖蛋白、補體以及其他細胞相互作用使整合素受到激活后，整合素通過踝蛋白和鈕蛋白使細胞肌動蛋白和微絲的結構發生變化，導致細胞骨架的重組，以及細胞形態的改變。

MKN1細胞形態學變化與整合素表達的增強之間的關系表明整合素β１的表達與胃癌MKN1細胞的粘附過程有直接關系，調節整合素β１的表達有可能影響胃癌MKN1細胞的粘附，即影響胃癌細胞的轉移。

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