【摘要】 目的 建立一種能很好模擬人體內(nèi)生物學(xué)行為的胃癌裸小鼠原位移植和轉(zhuǎn)移模型。方法 采用人胃癌SGC-7901細(xì)胞株在裸鼠皮下經(jīng)反復(fù)傳5代形成實體瘤的完整組織塊，建立人胃癌裸小鼠原位移植生長和轉(zhuǎn)移模型16個。觀察所建立的模型腫瘤生長狀況、移植成功率和自發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，常規(guī)H-E染色光鏡下觀察胃癌原位移植瘤、胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移情況。電鏡下觀察腫瘤超微結(jié)構(gòu)及免疫組化S-P法檢測腫瘤誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶-2（COX-2）。結(jié)果 胃癌裸鼠原位移植塊再次原位移植的原位成瘤率達(dá)100％（16/16），淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移率為87.5%（14/16），肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為75.0％（12/16），腹腔積液形成率為12.5%（2/16）。結(jié)論 原位移植和轉(zhuǎn)移模型均具有人胃癌自然生長過程的特點，具有人胃癌的生物學(xué)活性。 【關(guān)鍵詞】 胃腫瘤 腫瘤細(xì)胞 原位移植 疾病模型 裸小鼠 Abstract： Objective To develop a nude mouse model of human gastric cancer that can mimic its natural human biologic activities. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured in nude mice repeatedly for 5 generations to get the subcutaneous solid tumor， which was then emulsified and orthotopicly inplanted into the anterior wall of the stomach in 16 nude mice. The tumor growth characters， tumor-take rate and metastatic rate were studied grossly， the transplanted tumor and its lymphatic and hepatic metastases， after routine H-E staining; the ultrastructures， by electron microscopy; and COX-2， by immunohistochemical method． Results The tumor-take rate was 100％（16/16）， the rates of metastasis to lymph nodes and liver were 87.5％（14/16） and 75.0％（12/16） respectively， the rate of ascites formation was 12.5%（2/16）. Conclusion The model of human stomach cancer established is qualified， exhibiting natural growth characters and biological activities. Key words: stomach neoplasms; orthotopic thansplantation; disease model; nude mouse 既往胃癌動物模型的建立多采用皮下接種方式，雖然這種移植方式簡單易行，腫瘤的生長情況也便于觀察，且在一定程度上也近似地模擬了原有腫瘤的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)及生物化學(xué)特性；然而接種于裸小鼠皮下組織畢竟屬于異位移植，脫離了其起源組織器官的微環(huán)境，因此在實驗中移植瘤的某些行為常不同于患者原發(fā)惡性腫瘤的生物學(xué)行為。如移植瘤常有包膜、局限性生長、很少發(fā)生局部或遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，故未能很好地被應(yīng)用于研究人癌潛在的侵襲與轉(zhuǎn)移特性。我們選用低分化胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901通過裸鼠皮下傳5代后再原位移植建立的動物模型局部呈浸潤性生長、局部或遠(yuǎn)處有腫瘤轉(zhuǎn)移，為胃癌的研究提供了一個很好的載體。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 實驗動物 BALB/C/nu/nu裸小鼠由中科院國家嚙齒類上海實驗分中心購買，繁育自無特殊致病原 (special pathogen free， SPF)實驗動物屏障環(huán)境。雌雄兼用，5～6周，體重（17±2.5） g，分籠飼養(yǎng)（每籠5只）。實驗過程中均在SPF屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。實驗前1周購入小鼠，使之適應(yīng)新環(huán)境。 1.1.2 瘤株 人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株，由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供。癌細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代。 1.1.3 COX-2 羊抗人單克隆抗體及其免疫組化染色試劑盒購自蘇州福佑生物技術(shù)有限公司。 1.2 方法 1.2.1 人胃癌裸鼠原位移植和轉(zhuǎn)移模型的建立 1.2.1.1 皮下移植瘤模型的建立 收集體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞，使細(xì)胞含量為2×1010個/L，取0.1 ml注入裸小鼠頸部皮下形成實體瘤。至腫瘤直徑1.5 cm左右時，處死裸小鼠，切取腫瘤放入生理鹽水（含105 U/L青霉素和105 U/L鏈霉素）中，去除包膜，選擇近邊緣新鮮組織大約1 mm3以粗針穿刺接種于另一只小鼠，每次傳代4只，反復(fù)傳5代后作為原位移植用瘤源。 1.2.1.2 原位移植模型的建立 裸小鼠術(shù)前禁食12 h，以0.6％戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射（50 mg/kg）麻醉。常規(guī)消毒皮膚，取上述傳5代后生長3周左右處于對數(shù)生長期的荷瘤鼠，常規(guī)消毒，從頸部皮下剝?nèi)∧[瘤組織，剔除纖維包膜，切開選取生長良好、呈淡紅色、魚肉狀的瘤組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊，以8-0絲線穿過漿肌層將上述一塊瘤組織荷包縫扎在刮破漿膜的胃大彎前壁，荷包直徑約0.4 cm。分層關(guān)腹。術(shù)后精心飼養(yǎng)，每日觀察1～2次，每周稱1次體重。 1.2.2 光鏡和電鏡常規(guī)觀察腫瘤形態(tài)學(xué) 1.2.3 免疫組化S-P法檢測腫瘤組織誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn) COX-2表達(dá)陽性的判斷以>10%的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者判斷為陽性。 2 結(jié) 果 2.1 人胃癌組織塊原位移植瘤的生長情況 共建立供生長特性觀察的原位移植模型鼠16只，成功率100%（16/16）。移植術(shù)后3～4周于左上腹部可捫及直徑2～3 mm質(zhì)地較硬的結(jié)節(jié)，隨后腫瘤結(jié)節(jié)逐漸生長增大，5～7周時上腹部可捫及較明顯的腫塊，同一組荷瘤鼠腫瘤結(jié)節(jié)的大小略有差異。8～10周時，上腹部腫塊的直徑可達(dá)1.0～1.5 cm，大部分動物消瘦明顯，活動欠佳。以后瘤體繼續(xù)增大，腹部可見巨大瘤體突起，動物極度消瘦、倦怠，對周圍刺激反應(yīng)差，逐漸出現(xiàn)全身衰竭和死亡。荷瘤鼠一般的生存時間為12～15周，中位生存期13.5周。 2.2 大體解剖觀察 打開腹腔去除胃周圍組織可見（圖1）：看不到完整的胃壁，被腫瘤組織完全占據(jù)，表面呈結(jié)節(jié)狀，高低不平，觸及質(zhì)地較硬，切面均質(zhì)、魚肉狀，瘤體較大時中央有壞死區(qū)。胃壁腫瘤與網(wǎng)膜粘連，部分動物瘤體與肝、脾及腹壁粘連，大部分動物腹腔內(nèi)淋巴結(jié)腫大（圖2），部分荷瘤鼠肝臟中見有灰白色結(jié)節(jié)，少數(shù)動物腹腔內(nèi)有少量腹腔積液。 2.3 光鏡下觀察 光鏡下胃移植瘤細(xì)胞多呈橢圓形、核大、畸形、深染。瘤細(xì)胞排列呈巢狀或索狀，無明顯腺體結(jié)構(gòu)存在，在胃壁中呈浸潤性生長（圖3）。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)被癌細(xì)胞所充填，并破壞其組織結(jié)構(gòu)，發(fā)展成轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)（圖4）。肝轉(zhuǎn)移癌灶的組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)與胃移植瘤相一致，多在肝實質(zhì)的血管周圍形成，部分轉(zhuǎn)移癌灶的瘤細(xì)胞在肝組織中呈浸潤性生長，且已經(jīng)形成自身的較粗的血管系統(tǒng)（圖5）。 2.4 透射電鏡下觀察 透射電鏡下可見微絨毛突入細(xì)胞間隙，在許多緊密連接的細(xì)胞間能找到緊密連接、橋粒和縫隙連接。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器很豐富，以線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體為多（圖6）。 2.5 COX-2表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明：用人彌漫型胃癌細(xì)胞株SGC-7901（低分化胃腺癌）細(xì)胞建立的人胃癌裸鼠原位移植瘤均高表達(dá)COX-2，其陽性染色為棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)，無胞核著色（圖7）。 3 討 論 理想的胃癌裸小鼠人類腫瘤動物模型是研究腫瘤生長和轉(zhuǎn)移生物學(xué)以及尋求抗癌新藥和新方法的重要工具。這些模型必須能夠很好地模擬人體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)行為。一個很好的胃癌動物模型應(yīng)該具備腫瘤在局部呈浸潤性生長、局部或遠(yuǎn)處有腫瘤轉(zhuǎn)移以及微轉(zhuǎn)移的存在的條件［1］。要建立能很好地模擬人類腫瘤惡性生物學(xué)行為的移植模型，必須使用具有轉(zhuǎn)移潛能的瘤細(xì)胞，還必須讓其在相應(yīng)的器官環(huán)境中生長。 既往的胃癌模型建立常規(guī)采用的方法為在裸小鼠皮下植入人腫瘤細(xì)胞，生長出來的腫瘤組織在形態(tài)、功能、生化特征等方面與人胃癌十分相似，但因其周圍有結(jié)締組織包裹，即便是選用高轉(zhuǎn)移性的腫瘤也僅僅形成局部腫瘤，限制了其浸潤及轉(zhuǎn)移［2］。以后的研究發(fā)現(xiàn)，移植瘤是否能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移，不僅取決于瘤細(xì)胞本身的轉(zhuǎn)移潛能，還決定于宿主器官對應(yīng)的環(huán)境因素，裸鼠體內(nèi)特定的解剖部位所提供的微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為有重要的影響，而且腫瘤細(xì)胞和宿主微環(huán)境的相互影響對轉(zhuǎn)移過程的完成起著舉足輕重的作用［3］。1889年P(guān)aget提出“種子與土壤”學(xué)說（seed and soil hypothesis），認(rèn)為只有種子（瘤細(xì)胞）與土壤（患者器官微環(huán)境）相互作用才可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤。越來越多的學(xué)者認(rèn)識到腫瘤生長和親器官性轉(zhuǎn)移位點的微環(huán)境對于轉(zhuǎn)移鏈的各個環(huán)節(jié)均有不同程度的影響。因而提出建立人類腫瘤模型的原位移植（orthotopic transplantation）［2］：即將腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織直接種植到動物體內(nèi)相應(yīng)的器官，使其獲得與人體腫瘤相似的微環(huán)境。這一原位移植方式克服了上述所提到的異位移植存在的一些缺點。經(jīng)過細(xì)致的觀察發(fā)現(xiàn)：裸鼠的原位移植頗似臨床腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移特點，但其生長速度、生長動力學(xué)和轉(zhuǎn)移率高低各不相同，這可能取決于不同的腫瘤類型和細(xì)胞的生物學(xué)行為的不同［2，4-6］。

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