【摘要】目的：建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜（BBF）的模型，考察注射用雙黃連對BBF形成的影響及抑制作用。方法：在特定的條件、方法下分別對細菌單獨培養和細菌與提取物共同培養，通過酶標儀測量其OD值來考察BBF的生長能力。結果：注射用雙黃連對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌BDF的形成均有抑制作用。

【關鍵詞】雙黃連；細菌生物膜；影響

建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜（BBF）的模型，考察注射用雙黃連對BBF形成的影響及抑制作用。

1BBF模型的建立

1.1大腸桿菌BBF模型的建立1.1.1菌種的復活將大腸桿菌凍干粉加入0.4mlNB培養基溶解后，放入37℃恒溫振蕩器（230～240轉/分鐘）中培養8小時，分裝在離心管中，加入0.5ml的50%甘油，置于液氮中，于-80℃冰箱中冷藏保存。

1.1.2大腸桿菌BBF模型建立的方法將置于-80℃冰箱中的大腸桿菌劃線于NB培養基的平板上，置于恒溫培養箱中，于36℃培養24小時。挑取平板上的單一菌落溶于5mlNB液體培養基中，于36℃恒溫振蕩器中振蕩8小時，得到單克隆細菌增殖培養的菌液，備用。

將菌液稀釋100倍置于96孔板中，四周為NB培養基作為空白。置于恒溫培養箱中，于36℃培養24小時，取出。將菌液傾出，用蒸餾水反復清洗后，加入0.1%結晶紫染色30分鐘后，將結晶紫傾出，洗凈，加入1%脫氧膽酸鈉溶液，30分鐘后，測其600nm處的OD值。以菌液濃度為橫坐標，以OD值為縱坐標，考察BBF生長情況。

1.2影響大腸桿菌BBF生長的因素通過實驗的反復摸索，我們發現影響大腸桿菌BBF生長的因素主要有以下幾種：①菌種：不同的大腸桿菌菌株對BBF的影響很大，直接影響到BBF的生長與否和BBF形成的好壞。且大腸桿菌傳代越多，BBF的生長情況越不好，故我們每次實驗均采用大腸桿菌的第二代菌株。

②96孔板的材質：不同的細菌在不同材質的96孔板上的生長情況是不同的。我們選用了市場上常見的三種96孔板分別是進口聚氯乙烯（PVC）板，國產聚苯乙烯（PS）板，進口聚苯乙烯板，大腸桿菌分別在不同材質的96孔板上培養。結果，大腸桿菌在國產PS板上的生長情況是最好的。

③培養時間：考慮到實驗操作時間的可行性，我們選定將大腸桿菌分別培養18小時、24小時、36小時，考察BBF的生長情況。結果，大腸桿菌在培養24小時后，BBF的生長情況最好。

1.3金黃色葡萄球菌BBF的建立及影響因素金黃色葡萄球菌的BBF模型的建立方法基本上與大腸桿菌的相同。在這里就不做詳細的介紹。我們仍舊分別考察了96孔板的材質、培養時間及菌液濃度等因素，最終確定金黃色葡萄球菌菌液稀釋100倍、于國產PS板上培養24小時，BBF的生長的最好且穩定。

2.1培養方法的建立我們建立兩種方法分別考察藥物對BBF形成的影響及對BBF的抑制作用。96孔板的點樣方法1：四周為菌液（NB培養基）。B行加入180μl菌液（NB培養基），C～G行每孔各加入100μl菌液（NB培養基），B行每孔用移液槍加入20μl藥液，混勻，用多通道移液槍從B行吸出100μl移入C行，混勻，再從C行吸出100μl移入D行，依此類推至H行，吸出100μl后，棄去。即從B～H行藥液濃度以2倍遞減。96孔板的點樣方法2：四周為菌液。B～G行加入100μlNB培養基，B行每孔用移液槍加入100μl藥液，混勻，用多通道移液槍從B行吸出100μl移入C行，混勻，再從C行吸出100μl移入D行，依此類推至H行，吸出100μl后，棄去。即從B～H行藥液濃度以2倍遞減。

培養方法一：考察對BBF形成的影響。

按“96孔板點樣方法1”完成后，依照“大腸桿菌BBF模型建立的方法”中置于恒溫培養箱中，于36℃培養24小時，以藥液濃度為橫座標，以平均OD值為縱坐標，作圖，考察對BBF形成的影響。

培養方法二：考察對BBF的抑制作用我們先將96孔板全部點菌液，依照“大腸桿菌BBF模型建立的方法”置于恒溫培養箱中，于36℃培養24小時，取出，此時BBF已經形成，將菌液傾出，按“96孔板點樣方法”，將培養基培養24小時，以藥液濃度為橫座標，以平均OD值為縱坐標，考察對BBF的抑制作用。

2.2考察對BBF形成的影響

圖1注射用雙黃連對大腸桿菌BBF形成的影響

將注射用雙黃連加水溶解，配制成5mg/ml的藥液，分別進行對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養的操作。注射用雙黃連對大腸桿菌BBF形成的影響結果見圖1所示。

3討論

1）通過實驗摸索，建立了可靠而穩定的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜（BBF）的模型，確定了影響因素。

2）96孔板清洗方法的摸索：96孔板的材質是BBF模型能夠成功建立的重要因素，確定96孔板的清洗方法：先在96孔板內加注洗液，浸泡3～5分鐘后，用手握持96孔板，甩干孔內液體；再用乙醇浸泡24小時后超聲20分鐘，自然晾干，即可。

3）考察了注射用雙黃連對BBF形成的影響。得出注射用雙黃連對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌BBF的形成均有明顯的抑制作用。

4結語

本實驗建立了可靠而穩定的BBF模型，并通過此模型考察了中藥注射用雙黃連對BBF形成的影響，篩選出能夠抑制或破壞BBF形成的活性成分，為從中藥中開發治療慢性感染性疾病的新藥提供新的篩選模型，為科學、客觀評價中醫藥在治療慢性感染方面的作用提供了新的方法。

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