作者：王海英 章春筍 李彧媛

【摘要】 建立了一種基于毛細(xì)管的振蕩流反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)的微流控裝置檢測(cè)煙草花葉病毒(TMV)的新方法。根據(jù)TMV移動(dòng)蛋白基因設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，對(duì)粗提純TMV顆粒直接進(jìn)行RTPCR。用0.025%小牛血清蛋白(BSA)對(duì)反應(yīng)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行靜力學(xué)和動(dòng)力學(xué)鈍化，提高了PCR效率。在此微流控裝置上進(jìn)行RTPCR，流速為70 μL/min時(shí)， 檢出限為0.01 μg cDNA;可以在17 min內(nèi)成功擴(kuò)增出179 bp的目的DNA片段。

【關(guān)鍵詞】 微流控， 振蕩流， 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)， 煙草花葉病毒

1 引 言

在發(fā)病早期對(duì)植株的植物病毒進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)非常重要[1]。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)技術(shù)因其具有較高的靈敏度和特異性，已成為一種廣泛采用的生物檢測(cè)方法。RTPCR技術(shù)易與其它高靈敏度的檢測(cè)方法相結(jié)合，如電化學(xué)發(fā)光[2～9]、激光誘導(dǎo)熒光[10～13]和毛細(xì)管電泳[14]等檢測(cè)技術(shù)，使其檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高。

傳統(tǒng)PCR通常具有較大的熱容，熱循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，能量消耗高，且占有較大體積。為了克服這些缺點(diǎn)，一些研究者們開(kāi)展了PCR微流控技術(shù)的研究[15]。目前，微流控PCR有兩種形式：靜態(tài)池式PCR和動(dòng)態(tài)連續(xù)流動(dòng)式PCR。前者是傳統(tǒng)PCR微型化，主要對(duì)系統(tǒng)熱容進(jìn)行優(yōu)化，以減少加熱和冷卻時(shí)間。連續(xù)流動(dòng)式PCR則是PCR溶液在微通道中連續(xù)流動(dòng)，從而通過(guò)2個(gè)或3個(gè)恒溫區(qū)以實(shí)現(xiàn)溫度的循環(huán)。在該裝置中， PCR溶液變溫速度較快，而且可實(shí)現(xiàn)超高通量的反應(yīng)，因此受到人們的關(guān)注。

連續(xù)流動(dòng)式PCR可分為3種形式：蜿蜒通道單向流式PCR[16]、螺旋通道單向流式PCR[17，18]和直通道振蕩流式PCR[19，20]。前兩者反應(yīng)循環(huán)數(shù)和時(shí)間通常是固定的，很難根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整;也不宜進(jìn)行高通量平行反應(yīng)。為了解決上述問(wèn)題，研究者們提出直通道振蕩流PCR，反應(yīng)溶液在所需溫度區(qū)往復(fù)振蕩來(lái)實(shí)現(xiàn)PCR。本研究是在前期研究[18]的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了連續(xù)流動(dòng)式PCR的實(shí)現(xiàn)形式，在基于毛細(xì)管通道的振蕩流RTPCR微流控裝置上對(duì)煙草花葉病毒(TMV)進(jìn)行快速檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)粗提純的TMV顆粒直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到模板cDNA，然后進(jìn)行PCR。既省去了提取RNA的繁瑣步驟，又節(jié)省試劑成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，具有一定的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

振蕩流RTPCR裝置如圖1A所示。由溫度控制與采集系統(tǒng)(實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì))、3個(gè)銅加熱塊(由廣東省科學(xué)院自動(dòng)化工程研制中心加工)、3根加熱棒(直徑8 mm， 長(zhǎng)40 mm， 100 W， 廣州豪怡電熱電器廠(chǎng))、K型熱電偶 (直徑0.12 mm， Omega)和一臺(tái)CZ7490115精密注射泵(美國(guó)Cole Parmer公司)等構(gòu)成。溫度控制與采集系統(tǒng)通過(guò)加熱棒和熱電偶控制3個(gè)銅塊上PCR所需溫度。PTFE毛細(xì)管(無(wú)錫市祥健四氟制品有限公司)包埋在銅塊凹槽中，利用注射泵驅(qū)動(dòng)其中PCR溶液振蕩通過(guò)3個(gè)恒溫區(qū)，完成PCR反應(yīng)。傳統(tǒng)PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)。

RTPCR試劑中Taq聚合酶、dNTP及MMLV反轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)于寶生物(大連)有限公司。PCR上/下游引物分別為：5′ATGGAAAGAGCCGACGAG3′和5′ GAAAGCGGACAGA AACCC3′(上海生工生物技術(shù)有限公司)。小牛血清蛋白(BSA， 美國(guó)Sigma公司);聚乙二醇6000(PEG 6000，廣東光華化學(xué)廠(chǎng)有限公司)。

2.2 分析方法

2.2.1 病毒顆粒的反轉(zhuǎn)錄 PCR管中依次加入1 μL病毒顆粒提取液作為模板、1 μL引物(20 μmol)、ddH2O定容至7 μL，混勻離心3～5 s。70 ℃水浴5 min后，冰浴2 min，離心后依次加入1 μL 10×Buffer， 0.5 μL RNase Inhibitor (40 U/μL)， 0.5 μL dNTP Mix(10 mmol/L)， 1 μL MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)，終體積為10 μL。42 ℃保溫60 min后，于70 ℃ 加熱15 min結(jié)束反應(yīng)，置冰上保存，以備PCR實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 毛細(xì)管內(nèi)表面的處理 實(shí)驗(yàn)依次采用200 μL 0.5% NaClO，200 μL ddH2O， 200 μL 1×PCR緩沖液沖洗毛細(xì)管。用0.025% BSA對(duì)毛細(xì)管內(nèi)表面進(jìn)行靜力學(xué)和動(dòng)力學(xué)鈍化[18]，以便使PCR順利進(jìn)行。

2.2.3 振蕩流RTPCR擴(kuò)增 長(zhǎng)約20 cm PTFE毛細(xì)管包埋在3個(gè)銅加熱塊的凹槽中，每個(gè)銅加熱塊邊長(zhǎng)為4 cm×4 cm。溫度依次設(shè)定為94，72和56 ℃(在傳統(tǒng)PCR儀上優(yōu)化)。PCR溶液在毛細(xì)管中往復(fù)振蕩1次，完成1個(gè)PCR循環(huán)。PCR反應(yīng)時(shí)間以傳統(tǒng)PCR儀的擴(kuò)增時(shí)間為對(duì)照進(jìn)行優(yōu)化。5 μL PCR溶液從進(jìn)口處引入毛細(xì)管通道后，在注射泵驅(qū)動(dòng)下，以空氣為載流體來(lái)推動(dòng)溶液流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)振蕩流PCR。PCR溶液兩端各用石蠟油進(jìn)行密封，以防止蒸發(fā)。在振蕩流RTPCR中，5 μL PCR溶液中含有1×PCR緩沖液、0.2 mmol/L dNTP、0.5 μmol/L上/下游引物、4 μg/L模板cDNA、0.025 U/μL Taq 聚合酶、一定濃度的BSA以及相應(yīng)體積的ddH2O。 分 析 化 學(xué)第37卷第9期王海英等：微流控振蕩流反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速檢測(cè)煙草花葉病毒

3 結(jié)果與討論

3.1 對(duì)粗提純的病毒顆粒直接進(jìn)行RTPCR

病毒顆粒在70 ℃時(shí)就可熱裂解釋放出RNA，一次加熱可完成RNA分子的提取和變性，然后加入其它反轉(zhuǎn)錄試劑，完成RTPCR反應(yīng)。圖2中A和B分別是對(duì)病毒顆粒和提純的RNA進(jìn)行的RTPCR擴(kuò)增，條帶2初始RNA濃度均為0.2 g/L，2～9依次以10×梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)《绢w粒稀釋107倍后，仍可擴(kuò)增出產(chǎn)物，這說(shuō)明直接用粗提純的病毒顆粒進(jìn)行RTPCR反應(yīng)可以達(dá)到檢測(cè)的目的。

直接用病毒顆粒進(jìn)行RTPCR反應(yīng)不僅省略了提取RNA的繁瑣步驟，避免RNA提取試劑對(duì)操作者的危害，而且操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行。另外，RNA容易降解，不易保存，而提取的病毒顆粒可以直接在磷酸鹽緩沖液中方便保存。

3.2 模板濃度對(duì)RTPCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響

較大比表面積的毛細(xì)管會(huì)對(duì)PCR體系中各種成分產(chǎn)生吸附作用，對(duì)反應(yīng)有不良影響。PCR體系中的Taq酶、引物、dNTPs及Mg2+一般都是過(guò)量的，對(duì)反應(yīng)影響相對(duì)較小。然而模板cDNA濃度的變化對(duì)擴(kuò)增有較大影響。圖3是在流速為70 μL/min的情況下對(duì)不同濃度cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果。由圖3可知，cDNA濃度為1和0.1 g/L時(shí)可以很好地?cái)U(kuò)增出目的條帶;當(dāng)cDNA濃度為0.01 g/L時(shí)擴(kuò)增條帶仍然可以通過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)出;隨著濃度進(jìn)一步降低，已經(jīng)無(wú)法檢測(cè)出條帶，只有少量的引物二聚體出現(xiàn)。 圖3 cDNA模板濃度對(duì)振蕩流RTPCR擴(kuò)增的影響

3.3 樣品流動(dòng)的變速和恒速對(duì)振蕩流RTPCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響

PCR擴(kuò)增過(guò)程中樣品一旦到達(dá)變性溫度應(yīng)迅速冷卻到退火溫度，完成引物與模板的配對(duì)，這一步對(duì)PCR效率影響很大。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變振蕩流兩個(gè)方向的流速，增大由變性區(qū)到退火區(qū)的流速，減少其流動(dòng)時(shí)間，明顯提高了PCR效率。如圖4所示，在同一流速(70 μL/min)下， 由94 ℃變性到56 ℃退火所用時(shí)間為52 s，而把由94 ℃變性到56℃退火的流速提高了4倍后，反應(yīng)時(shí)間縮短到13 s，而擴(kuò)增效率卻有了很大的提高。

3.4 傳統(tǒng)PCR儀與振蕩流RTPCR微流控裝置進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的比較中條帶1是在傳統(tǒng)PCR儀上經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)(94 ℃，30 s; 54 ℃，30 s; 72 ℃，30 s)，擴(kuò)增時(shí)間1 h的擴(kuò)增結(jié)果;條帶2為陰性對(duì)照;條帶3是振蕩流RTPCR的擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)過(guò)35個(gè)PCR循環(huán)，擴(kuò)增時(shí)間30 min。由圖5可以看出振蕩流微流控裝置可以對(duì)目的DNA片段進(jìn)行成功的擴(kuò)增，并且擴(kuò)增時(shí)間明顯縮短。

3.5 煙草花葉病毒雙溫振蕩流RTPCR的快速檢測(cè)

當(dāng)DNA擴(kuò)增片斷小于300 bp時(shí)，退火溫度與延伸溫度可以合并，即雙溫PCR。本實(shí)驗(yàn)以反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板，進(jìn)行雙溫PCR擴(kuò)增。通過(guò)優(yōu)化流速和縮短反應(yīng)時(shí)間，可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出反應(yīng)產(chǎn)物。如圖6所示，隨著流速的加快，擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量逐漸減少，35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增時(shí)間減小至17 min時(shí)仍可以擴(kuò)增出產(chǎn)物。通常情況下由于底物的消耗和酶活力降低，PCR反應(yīng)在25～30次循環(huán)就達(dá)到平臺(tái)期，PCR產(chǎn)物不再上升。在模板濃度較高的情況下，20次循環(huán)就可檢測(cè)出產(chǎn)物，反應(yīng)時(shí)間可以減少3/7。