作者：溫星橋，李小娟，羅云，王林，周祥福，蔡育彬，溫機靈，高新

【摘要】 【目的】 探討生育酚結合蛋白(TAP)對前列腺癌細胞的生長調節及其分子機制。【方法】四甲基偶氮唑鹽生長試驗(MTT)測定細胞增殖情況，體外集落形成試驗測定各細胞的致癌能力，高效液相層析法檢測細胞內維生素E的濃度，利用基因轉染、基因沉默、免疫印跡、Northern blot， RT-PCR、熒光定量PCR、免疫沉淀等方法研究TAP對前列腺細胞生長的作用及機制。【結果】 TAP mRNA水平在前列腺癌細胞 LNCaP、PC-3、DU-145、CWR22R中均較正常前列腺細胞RWPE-1低。TAP 可促進癌細胞保留維生素E并增強其抗前列腺癌增殖的效應。無維生素E作用下，轉染TAP可抑制前列腺癌細胞LNCaP、DU-145的生長，第6天細胞數比對照組分別減少35.8％與42.4%；LNCaP細胞克隆形成率下降54.3％（P< 0.05）。利用siRNA在良性前列腺細胞 HPr-1中沉默TAP基因，培養9 d后，細胞數比對照組增加124.3％（P< 0.01）。TAP通過抑制磷酸肌醇PI3激酶信號，而非通過影響細胞周期或雄激素受體信號發揮作用。免疫沉淀實驗表明TAP通過抑制PI3K的亞單位p110與p85的相互作用，進而干擾PI3K-Akt信號通路；持續激活Akt的活性可削弱TAP對前列腺癌細胞生長的抑制能力。【結論】 TAP不僅能促進前列腺癌細胞攝取和增強維生素E的抗前列腺癌效應，還可通過非維生素E途徑發揮作用，可能是防治前列腺癌的有價值的分子靶點。

【關鍵詞】 生育酚結合蛋白； 前列腺癌； 磷酸肌醇3激酶

前列腺癌的發病除與種族、遺傳因素有關外，還與營養及飲食結構等多種因素有關。近來有多項大型多中心臨床研究表明維生素E可降低前列腺癌的發病率[1，2]。α-生育酚結合蛋白(α-tocopherol-associated protein， TAP)是新近識別出來的、能與α-生育酚（維生素E的一種活性最強的存在形式）特異性結合的新蛋白，主要表達于肝、腦、前列腺等器官。TAP在前列腺癌發病的作用機制未明。前期研究發現TAP可參與吸收、轉運維生素E[3，4]。本研究旨在通過體外實驗探討TAP對前列腺癌生長的作用和分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞來源

LNCaP、PC-3、DU-145和RWPE-1細胞（由轉染乳頭狀病毒HPV18而永生化的正常前列腺外周帶的上皮細胞）從美國ATCC（American Type Culture Collection）購買；CWR22R細胞來自Dr. CH Kao(美國Indiana University)；HPr-1細胞（由轉染乳頭狀病毒HPV16 E6/E7而永生化的正常前列腺細胞）來自Dr. YC Wong (University of Hong Kong)。

1.2 化學試劑

α、γ-生育酚（α、γ-tocopherol）、Flag-M2抗體購自美國Sigma公司；PI3K p110、phospho-FOXO3a、Akt和actin抗體購自美國Santa Cruz公司；FOXO3a 和 PI3K p85 抗體購自Upstate Biotechnology 公司；抗Ser473抗體購自Cell Signaling Technology 公司。雄激素受體抗體和pCDNA3-cAkt質粒來源如文獻報道[5]。

1.3 質粒構建

從前列腺增生細胞的cDNA中分離全長TAP序列， 克隆入pCDNA3-flag載體，用pMSCV/U6（包含有抗puromycin 的標記，來自Dr. P.Silver， Harvard Medical School），構建TAP siRNA寡核苷酸鏈GCATGTGGAGTTCCGAAAGTTCAAGAGACT TTCGGAACTCCACATGCTTTTTT，克隆入pMSCV/U6質粒的ApaI-EcoRI位點，構建成pMSCV/U6-TAPsiRNA，所有構建產物均通過測序證實。

1.4 質粒轉染

用脂質體轉染法（SuperFect，購自Qiagen公司）或者電轉染法。電轉染 (機器購自Bio-Rad公司)，用懸浮在體積分數2.5% FBS (不含抗生素)的對數生長期細胞，濃度為107個細胞/mL，參數設置：電壓280 mV，電容 950 μF，樣本容積400 μL，每次轉染DNA總量10 μg。

1.5 細胞培養

LNCaP、PC-3和CWR22R細胞以含體積分數10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的RPMI 1640液（美國Gibco公司）培養[4]，DU-145細胞以含體積分數10%FBS的DMEM液培養。RWPE-1和HPr-1細胞（兩者雖均為前列腺上皮細胞株，但內源性TAP含量不一樣）用KSF液(Life Technologies公司)培養。

1.6 細胞生長曲線及集落形成能力

四甲基偶氮唑鹽[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide， MTT] 法測定生長曲線， 取轉染TAP的對數生長期細胞， 3×104 個/孔， 接種于12 孔培養板， 平行接種3 孔轉染空載體的細胞作對照。第0、2、4、6天 測定，繪出曲線圖。集落形成測定：在6孔培養皿上，每孔加入5 000個細胞， 一式3份， 用新鮮培養液培養， 每4 d更換一次；15 d后， 甲醇固定， 用1%龍膽紫染色后進行集落計數。

1.7 維生素E濃度測定

細胞裂解后以0.3 mL 1% 抗壞血酸加0.1 mol/L 硫代硫酸鈉溶解。維生素E組份以0.8 mL 己烷提取。于氮氣下風干，殘留成份以2.5％ 抗壞血酸及甲醇溶解，并用高效液相層析法分析檢測，以彩色熒光探測儀 (美國Waters公司) 及相應軟件分析結果。

1.8 免疫印跡（Western blot）

50 μg的蛋白以SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至硝酸纖維膜上[6]。室溫下封閉1 h（封閉液為含有0.1% Tween 20 和10%血清的PBS液）后，加一抗室溫下孵育1 h，漂洗后加入堿性磷酸酶標記的二抗，室溫下反應1 h，充分漂洗后，用堿性磷酸酶反應物(Bio-Rad公司)顯色。

1.9 Northern blot

用Trizol液(Life Technologies公司) 提取細胞總RNA。15 μg總RNA以10 g/L瓊脂糖甲醛凝膠電泳，電轉移至Hybond-N+膜（Amersham Pharmacia公司）上。TAP cDNA用[α-32P]dCTP標記（Random Labeling試劑盒， Amersham Pharmacia），用Rapid-Hyb 反應液（Amersham Pharmacia公司）將膜進行雜交，表達信號用放射顯影儀分析檢測。

1.10 免疫沉淀分析

4 ℃下用500 μg 細胞裂解液與抗p110或p85抗體，連續震蕩孵育2 h，將25 μL A/G蛋白珠加入每管中，連續震蕩孵育2 h。用PBS緩沖液沖洗4遍，收集 A/G蛋白珠重新懸浮在蛋白上樣液中，煮沸5 min，凝膠電泳后以Western blot 檢測。

1.11 半定量和實時定量PCR

用Superscript Ⅱ 試劑盒 (美國Invitrogen公司) 逆轉錄。引物為: TAP， 5′-CCAGGCAGAAGG AGGCATTG-3′ 和5′-TCGGAG CCAAC GCAGG AG-3′；TTP， 5′-TCAGCGGAATG GAATCAAGG-3′和 5′-ATCCGTAAG TACAGCAGCAATC -3′;細胞視黃醇結合蛋白(CRALBP): 5′-CACGCTGCCCAA GTATGATG-3′ 和5′-CCAGGACAGTTGAGG AGAGG -3′；18S rRNA，5′-TGCCTTCCTTGGATGT GGTAG -3′ 和5V-CGTCT GCCCTATCAACTTT CG-3′。 實時定量PCR按照SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) 說明書進行，反應條件：94 ℃變性 3 min，94 ℃下30 s ， 60 ℃退火30 s，然后72 ℃下延伸30 s，共40個循環，用iCycler iQ 實時PCR檢測系統 (Bio-Rad)，每份標本重復3次計算而得。

1.12 統計學處理

用SPSS 14.0統計軟件進行處理。兩組間均數的比較用t檢驗，率的比較用χ2 檢驗，多組間比較用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 TAP在前列腺癌細胞表達下調

Northern blotting 檢測TAP mRNA 在惡性前列腺細胞中的表達比良性細胞明顯下降（圖1A）；real-time PCR發現與正常前列腺細胞RWPE-1比較，LNCaP， PC-3和CWR22R內的TAP mRNA 表達明顯下調（real-time PCR以RWPE-1內的TAP水平設定為1，其余細胞內TAP量以iCycler iQ 軟件算出相對值，圖1B）。

2．2 TAP可促進前列腺細胞攝取維生素E

用 pCDNA3-flag-TAP質粒轉染 LNCaP細胞，以G418 選擇性培養后獲得幾個穩定表達的細胞克隆(LN-TAP5， 7， 9， 和10)，以flag抗體行Western blot 表明細胞內有較強的TAP蛋白表達（圖2）。向穩定表達TAP的細胞加入20 μmol/L α、γ-生育酚和維生素E琥珀酸鹽(vitamin E succinate， VES) 處理12 d，細胞內VitE含量較對照組增加62.5％、73.2％、48.5％。

2.3 過表達TAP可抑制前列腺癌的生長及增強維生素E的抗增殖作用

克隆形成實驗提示轉染TAP后，LNCaP細胞克隆形成數較對照組平均減少54.3%（P< 0.01）。向激素依賴性前列腺癌細胞LNCaP外源性表達TAP后第2、4、6天可見到細胞減少15.2％、26.5%、35.8％（P< 0.01；圖3A）。向LNCaP細胞轉染TAP，再加入 20 μmol/L VES處理，第2，4，6天可見到細胞比對照組減少34.8％、52.7%、81.9％（P< 0.01），抑制程度明顯大于無轉染TAP的情況。 向激素非依賴性前列腺癌細胞DU-145轉染TAP，第2，4，6天可見到細胞減少17.5％、29.3%、42.4％（P< 0.01）。如圖3B，利用RNA干擾技術下調正常前列腺細胞HPr-1內源性TAP的表達，培養9 d后，MTT測定表明轉染下調TAP后，細胞數比對照組增加124.3％（P< 0.01）。

2.4 TAP調節 PI-3K-Akt 信號途徑

Western blot檢測細胞內雄激素受體（androgen receptor， AR）的表達，轉染TAP組和對照組AR表達水平沒有差異（圖4A）。穩定表達TAP的LNCaP細胞克隆 (LN-TAP5， 7， 9)、對照細胞 LN-V1 和母系 LNCaP 行Western blot 檢測表明TAP 表達與 Akt磷酸化程度呈負相關，富含TAP的細胞內部Akt蛋白的磷酸化程度很低。

穩定表達TAP的LNCaP細胞與對照細胞 LN-V1的裂解液與抗p110或p85抗體分別共孵育行免疫沉淀，如圖4B，Western blot 檢測提示TAP 干擾 p110 與 p85二聚復合體的形成。向LN-TAP5 細胞內轉染持續激活的Akt，同時轉染GFP以檢測轉染效率。如圖4C，Western blot檢測細胞內有Akt表達，MTT結果表明激活Akt可削弱TAP對前列腺癌細胞的抑制作用。電轉染法轉染TAP后可減少LNCaP細胞內Akt磷酸化程度，加入α－生育酚并不能進一步加強TAP對Akt磷酸化的抑制（圖4D）。

3 討 論

本研究發現TAP在多種前列腺癌細胞如LNCaP、DU-145、CWR22R的表達比正常前列腺細胞RWPE-1的表達水平明顯下降，與我們前期應用原位雜交和免疫組化測定TAP在前列腺癌的表達比在良性前列腺增生明顯減弱的發現相吻合[7]。在前期研究中，我們已經發現TAP陰性的前列腺癌患者手術前PSA水平、Gleason評分均高于TAP陽性患者，術后出現臨床復發時間（32.5±6.2）個月小于TAP陽性患者（78.5±12.6）個月，表明TAP與前列腺癌的惡性程度存在負相關關系[7]。

探索維生素E在前列腺細胞內的轉運及作用機制對防治前列腺癌有重要意義，已知維生素E可作用于前列腺癌細胞周期并抑制其增殖[8]，Thompson 等[9]發現維生素E的色原烷醇部分PMCol具有抗雄激素活性。為評價硒和α-生育酚對前列腺癌的預防作用，美國國立癌癥研究院2001年專門開展了一項共32 400例參與者的、長達12年的大型前瞻性研究（SELECT）[2，10]。本研究為進一步闡明TAP在前列腺癌的發病機制提供了良好的實驗基礎，發現TAP可促進前列腺癌細胞對維生素E的攝取、保留能力，TAP與α-生育酚有很高的親和能力，表明維生素E抑制前列腺癌的作用受TAP的調節，臨床上應用維生素E防治前列腺癌時，如果配合增強TAP信號在前列腺細胞的表達，可望發揮更好的效果。

迄今為止TAP在前列腺的作用機制未明，PI3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt信號是前列腺癌細胞的重要生存信號途徑。我們發現TAP可干擾P110α-P85復合體的形成，下調Akt的磷酸化程度。PI3K是由催化亞單位p110和調節亞單位p85所組成的二聚體蛋白， 具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性，TAP抑制該兩亞基的相互結合、可降低PI3K的活性，影響PI3K及其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt所組成的信號通路，可能在前列腺癌的發病與腫瘤進展中起重要作用。TAP還可抑制Akt下游信號FOXO3a的磷酸化，與Kempna等[11]發現TAP在白血病細胞中可下調PI3K/P110γ活性的發現相吻合。Yamauchi[12]發現TAP可進入細胞核參與核內信號轉導，但其調控效應未明。雄激素受體在前列腺癌細胞的增殖和生存能力中起重要作用，我們檢測轉染TAP的LNCaP細胞內AR的表達水平，發現AR表達并不受TAP干擾。進一步研究TAP參與前列腺細胞的信號轉導機制，將有利于闡明TAP抗前列腺癌的機理及更好地利用維生素E防治前列腺癌。抑癌基因的突變或者不正常表達是腫瘤發生的重要原因，如Ras相關域家族因子[13]，前髓細胞白血病基因[14]等， 本研究結果提示TAP可能與以上基因有類似之處，在前列腺癌的發病中扮演抑癌基因的角色。

總之，TAP是首個被發現具有抑制前列腺癌增殖作用的維生素E結合蛋白，不僅能促進前列腺癌細胞攝取維生素E、還可通過非維生素E途徑抗前列腺癌，TAP可能是防治前列腺癌的有價值的分子靶點。

(感謝：美國羅徹斯特大學泌尿外科Messing E.教授等對本實驗的指導和幫助)