【摘要】 目的: 探討低濃度α生育酚對神經元細胞膜的保護作用. 方法: 培養SD胎鼠皮層神經元細胞作為實驗對象. 將神經元細胞進行分組：正常對照組、氧自由基損傷組和不同濃度α生育酚處理組(10，20，40和80 mg/L). 用Fenton反應對神經元細胞膜造成損傷. 在損傷后1及2 h分別對各組神經元進行PI染色，利用激光共聚焦顯微鏡觀察神經元細胞膜的損傷情況，并用TBA法檢測神經元細胞外液中丙二醛(MDA)生成量. 結果: 80 mg/L濃度α生育酚可減少氧自由基對神經元細胞膜的損傷， 且可減少MDA生成量. 結論: 80 mg/L濃度α生育酚可以有效對抗氧自由基對神經元細胞膜的損傷.

【關鍵詞】 α生育酚 神經元 細胞膜 低濃度

0引言

氧自由基是引起顱腦損傷等多種中樞神經疾病繼發損傷的重要因素. 而維生素E是一種天然的抗氧自由基物質. 維生素E共包括8種分子，其中α生育酚為公認抗氧自由基最有效的［1］. 在近年的研究中，已證實α生育酚可阻止氧自由基對細胞膜中多不飽和脂肪酸及膜蛋白的攻擊，防止細胞膜功能的喪失［2］. 然而國內外學者對應用多大濃度的α生育酚才可有效保護細胞膜有很大分歧. 本實驗我們利用Fenton反應形成氧自由基對胚胎大鼠皮層神經元的損傷，觀察低濃度α生育酚對神經元細胞膜的保護作用.

1材料和方法

1.1材料α生育酚、碘化吡啶（PI）染料（Sigma公司，美國）；2.5 g/L胰蛋白酶、0.2 mol/L EDTA、各種細胞培養液（GibcoBRL公司，美國）；MDA檢測盒，購于南京建成生物公司；300 mL/L雙氧水，硫酸亞鐵，維生素C和無水乙醇，均為國產分析純. 孕14 d的SD大鼠2只，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心. TE200E型激光共聚焦顯微鏡觀察( NIKON公司， 日本)；TG150型二氧化碳培養箱(Jouan公司，法國)；CR22G型離心機（日立公司，日本）；UV240型紫外分光光度計（島津公司，日本）.

1.2方法

1.2.1α生育酚水溶液配制取α生育酚10 mg溶于1 mL無水乙醇中，將無水乙醇緩慢滴入49 mL 30℃去離子水中，制成200 mg/L α生育酚水溶液母液備用. 碘化吡啶染料配制：將碘化吡啶粉末以去離子水溶解為終濃度為1 mg/L工作液.

1.2.2SD大鼠皮層神經元分離及培養將實驗大鼠斷頸處死，取胚胎腦皮層組織，剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 mmol/L EDTA，令其分散成單細胞懸液，過200目不銹鋼網，于37℃， 50 mL/L CO2培養箱中進行培養. 隔日換液. 培養到第4日，細胞懸液于離心機中以1000 r/min速度離心10 min，去沉淀細胞，加入神經元培養液，接種于涂有鼠尾膠原的25 cm×25 cm細胞培養瓶中，使干細胞轉化為神經元，隔天換藥一次，第6日使用.

1.2.3實驗分組將所有神經元培養瓶進行分組，共分為：正常對照組；氧自由基損傷組；不同濃度α生育酚處理組（10， 20， 40和80 mg/L亞組，與神經元作用1 h后備用）.

1.2.4利用Fenton反應造成神經元氧自由基損傷按照Yamazaki等［3］方法，在培養皿中加入硫酸亞鐵、維生素C和300 mL/L雙氧水，使溶液中硫酸亞鐵終濃度為0.2 mmol/L，維生素C終濃度為0.2 mmol/L，雙氧水終濃度為0.4 mmol/L，制作氧自由基損傷模型.

1.2.5PI染色按照袁蘭等［4］方法，將PI粉末以去離子水溶解為終濃度1 mg/L工作液. 將氧自由基損傷組及α生育酚處理組及正常組培養瓶中加入試劑后，立即開始計時，并取反應開始后1和2 h培養瓶中的神經元進行PI染色，將PI工作液100 μL均勻滴在神經元細胞上，置于暗室中染色15 min，用pH 7.0 PBS液沖洗3遍.

1.2.6激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態激光共聚焦顯微鏡熒光激發波長為567 nm，發射光波長大于590 nm，偽彩色采用紅色，在保證信噪比的情況下盡量增大檢測的pinhole和PMT. 選定5個圖像清晰的視野，在200倍鏡下觀察. 細胞紅染者為細胞膜損傷細胞，未染色者為正常細胞［4］. 每個視野隨機計數100個神經元，記錄其中有細胞膜損傷的神經元數，共記錄5個視野內神經元，計算平均值.

1.2.7MDA測定采用MDA檢測盒，結合紫外分光光度計，按照TBA法分別檢測各組神經元培養瓶中溶液的MDA濃度. 每一次取0.1 mL溶液檢測，每瓶測值為該瓶溶液的MDA濃度.

統計學處理：所有數據以x±s表示，多個樣本間均數比較用方差分析，用StudentNewmanKeuls(SNK)法進行多組間兩兩比較. P<0.05認為差異有統計學意義.

2結果

2.1神經元細胞膜損傷分析正常對照組只有極少熒光染色陽性細胞，而損傷組和α生育酚處理組均有熒光染色陽性細胞（圖1，2）. α生育酚濃度為正常生理濃度10 mg/L時，不能有效消除Fenton反應所造成的氧自由基損傷. 而當α生育酚達到80 mg/L時，細胞膜損傷的神經元總數減少，有統計學意義.

2.2MDA結果分析80 mg/L α生育酚處理組MDA產生量低于單純氧自由基損傷組（表2），但仍高于正常對照組.表1碘化吡啶染色結果比較表2不同處理組的MDA值比較

3討論

氧自由基對于細胞膜有很多的損害［5］，所以，抗氧自由基治療是減少顱腦損傷等病理狀況下神經元損傷的重要手段.

α生育酚與氧自由基反應后，生成α生育醌，減少氧自由基與其他分子反應［2］. α生育酚為脂溶性，血漿濃度為5~10 mg/L. 在細胞膜中，維生素E與不飽和脂肪酸的比例為1∶1000，可以有效地消除正常生理狀況產生的氧自由基對細胞膜的損傷. 在病理情況下，氧自由基大量產生，5 min內即可使血漿內的α生育酚濃度大幅下降，不能有效的對抗氧自由基的損傷［6］. 因此，早期補充α生育酚減少氧自由基對細胞的損傷，成為人們較感興趣的治療策略.

De Jesus Ferreira等［7］主張保護細胞膜的α生育酚濃度應達到1 g/L，才能有效對抗氧自由基的破壞作用. Sperling等［8］ 甚至提出可用100 g/L濃度的α生育酚進行神經元保護是可行的方案. 賈麗紅等［9］在對神經膠質細胞試驗中，認為50 mg/L α生育酚即可起到抗氧化的保護作用. 而國內尚少有低濃度α生育酚對神經元保護作用的報道. 從本試驗可以看出，正常血漿濃度8~10倍的α生育酚即可產生較為明顯的神經元細胞膜保護作用，細胞膜脂質多不飽和脂肪酸氧化產物MDA也小于單純氧自由基損傷組. 而且，80 mg/L α生育酚組在損傷后2 h存在細胞膜損傷的神經元為（41.5±5.9）個，少于損傷后1 h存在細胞膜損害的神經元（66.0±7.3）個. 這種現象是否意味著α生育酚可促使損傷細胞膜發生自我修復改變，尚需深入研究. 低濃度α生育酚的治療作用對于臨床應用較有意義. 因為現今應用α生育酚進行動物試驗，多采用口服及腹腔注射兩種方法. 而生物體內的α生育酚主要存在于肝臟，不能自由穿過血腦屏障，所以這兩種方法均不能使腦組織中的α生育酚濃度達到很高濃度. Naziroglu等［10］采用口服800 mg，僅能使血漿中α生育酚達到21 mg/L，腹腔注射160 mg/kg α生育酚后，血漿中α生育酚可達到類似結果. Cherdyntseva等［11］在研究中發現，給與SD大鼠標準腹腔注射量α生育酚（600 mg/kg）每天進行腹腔注射，只能使血漿中α生育酚濃度達到80 mg/L. 高濃度的α生育酚在以往的實驗中顯示可以使氧自由基對神經元損傷減少到較低的程度［8-9］. 但在當今條件下，臨床無法達到使腦組織和血漿中α生育酚達到至1 g/L的水平，而且，如此高濃度的α生育酚在腦組織中是否會引起不良反應尚無定論. 相反，在顱腦損傷等情況下，血腦屏障受到損傷，則可很容易地使傷區腦組織中α生育酚濃度達到接近80 mg/L的水平，從而達到治療目的. 這使臨床應用α生育酚治療顱腦損傷等神經系統疾病成為可能.

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