作者：鄒寶林 袁水橋 于化洲 周玉言 孫緒磊 王冰松 李強(qiáng)

【關(guān)鍵詞】 生育能力 保存 修復(fù) 研究

30多年前人類體外受精技術(shù)（IVF）的成功為人類生育能力的修復(fù)提供了一種生物學(xué)模式的治療手段，同時也開創(chuàng)了人類輔助生殖技術(shù)的新紀(jì)元。而在整個輔助生育過程中，配子、胚胎以及生殖器官的保存則是不可或缺的一環(huán)。隨著低溫生物學(xué)的發(fā)展，人類配子和胚胎已完全可以在體外長期保存而不影響其發(fā)育潛能，但大部分經(jīng)過化療和放療的癌癥患者的生育能力的保存問題仍為我們廣大輔助生殖工作者所關(guān)注。雖然配子的體外發(fā)育和成熟培養(yǎng)的系統(tǒng)研究還處于初級階段，但雌雄配子或性腺組織的冷凍貯存技術(shù)仍在不斷發(fā)展。這些新型輔助生殖技術(shù)的安全性也是值得關(guān)注的問題。

1 男性生育能力的保存和修復(fù)

1.1 精液的冷凍保存 人類精液的冷凍保存技術(shù)具有良好的發(fā)展基礎(chǔ)，并被常規(guī)應(yīng)用于供精I(xiàn)VF中。但是，冷凍保存損傷了原精液中的大部分精子（接近50%），且降低了精子的活動力，也就需要比新鮮精液用量更多的冷凍-解凍精液才能成功完成受精（Holt，2000）。因此，精液的冷凍保存對于那些精子含量少且精液質(zhì)量差的患者來說，就不是那么理想了，盡管卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）的發(fā)展在很大程度上緩解了這一問題。最近的研究結(jié)果顯示，從附睪和睪丸中取出的精子經(jīng)冷凍-解凍后進(jìn)行ICSI，獲得了相似的受精率（接近60%）和妊娠率［1］。從睪丸活檢組織中獲得的人類精細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，然后解凍并用于ICSI，結(jié)果誕生了一個健康的嬰兒［2］。

1.2 人類精子的體外成熟和移植 化療或放療可以導(dǎo)致長期或永久性的無精子癥。現(xiàn)在，那些接受放化療的男性可以通過冷凍保存將他們的精子儲存起來。而對于需要癌癥治療的未達(dá)到性成熟男孩，將其睪丸的活體組織冷凍保存起來可能就是唯一保存其生育能力的方法［3］。待到他們?nèi)院螅瑢⒆泽w生殖細(xì)胞移植回成熟的睪丸中，進(jìn)而有望再造生精能力，這將是癌癥患者治療后保存其生育能力的有效治療方法。目前已成功地將異種小鼠睪丸細(xì)胞移植到遺傳性不育的小鼠體內(nèi)，而且，使來自某一物種的睪丸精子在另一個物種的睪丸中成熟也已實現(xiàn)［4］。小鼠的生殖細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)和冷凍保存之后的移植也獲得了成功。

1.3 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI） 在IVF過程中，可用精子的數(shù)量少會造成受精失敗。在這種情況下，可以將單個精子注射到成熟的MⅡ期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，促使其受精融合，這種方法通常被稱為卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ISCI）。第一例ICSI成功受孕是在20世紀(jì)90年代初［5］。此后，這項技術(shù)成為嚴(yán)重男性不育患者所廣泛接受的治療方法。如果精液中沒有精子，可以從附睪中抽取（附睪精子顯微抽吸術(shù)，MESA）或直接從睪丸中抽取（睪丸精子抽取術(shù)，TESE）。與ICSI相結(jié)合，MESA和TESE可以使阻塞性無精子癥和非阻塞性無精子癥（先天性輸精管缺失或精子成熟障礙）的男性擁有自己的孩子［6］。使用從精液、附睪和睪丸中獲得的精子進(jìn)行ICSI，其受精率（接近60%）、卵裂和妊娠率（接近20%）都很相近，沒有明顯差別［6］。在精子不能達(dá)到成熟的情況下，注射未成熟的精細(xì)胞或精母細(xì)胞也能發(fā)生妊娠［7］。使用未成熟的精細(xì)胞進(jìn)行ICSI的成功率很低，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能在于，已經(jīng)凋亡和DNA損毀的生殖細(xì)胞在患有嚴(yán)重睪丸衰竭的男性生殖細(xì)胞中所占比例過大［7］。生殖細(xì)胞的體外成熟可以幫助選擇未受損的細(xì)胞進(jìn)行ICSI，并且對于成功受精也是十分必要的。

1.4 ICSI的風(fēng)險 盡管目前ICSI作為男性不育的治療手段已被廣泛應(yīng)用，但仍需考慮其安全性和對后代的長期影響。ICSI是直接以人類實驗為基礎(chǔ)發(fā)展起來的。用其他物種如獼猴做的基礎(chǔ)性研究，直到現(xiàn)在還在進(jìn)行當(dāng)中，而且行ICSI后的細(xì)胞核重組異常和精子染色體不凝聚現(xiàn)象已經(jīng)凸顯出來。ICSI繞過了許多受精過程中的潛在控制點(diǎn)（如精卵接觸并穿過透明帶以及精子與卵膜的融合）使得活動力差或形態(tài)異常的精子也能完成受精。行ICSI以后，性染色體的畸變頻率會稍有提高［8］。原因是這一操作過程可能擾亂了卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂紡錘體或精子染色體的凝聚，導(dǎo)致染色體不發(fā)生分離。不育男性染色體組型異常的較高發(fā)生率引起了對男性不育傳遞的危險性的關(guān)注。此外，還應(yīng)該對使用ICSI技術(shù)誕生的孩子產(chǎn)后發(fā)育遲緩的事實進(jìn)行討論和關(guān)注［8］。隨著使用未成熟精子、精細(xì)胞和精母細(xì)胞進(jìn)行ICSI的病例不斷增加，以及2例先天性畸形的報道［9］，使得對生精過程中基因表達(dá)和基因組印刻進(jìn)行深入研究的重要性與日俱增。

2 女性生育能力的保存和修復(fù)

2.1 胚胎的冷凍保存 IVF多胎妊娠發(fā)生率的升高使很多生殖中心都對移植胚胎的數(shù)量進(jìn)行了限制。胚胎的冷凍保存使IVF后獲得的多余的胚胎被保留下來，在以后的周期解凍并移植，活產(chǎn)率約為12%。另一方面，年輕癌癥患者的發(fā)生率顯著增高，這就使保存他們的生育能力成為一種需求［10］。雖然患者可以在實施癌癥治療之前先將胚胎保存起來，但這需要將近6周的有潛在危險的治療延遲期。而且在一些情況下，胚胎冷凍保存是不可行的，例如兒童患者不適用，未婚的年輕女患者則可能無法接受。對于這些女性，可采取的替代方法為卵母細(xì)胞或卵巢組織的冷凍保存。

2.2 卵母細(xì)胞的冷凍保存 Chen［11］曾報道了成熟卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍保存后的第一例成功受孕。但是，這種方法的成功率仍然很低。解凍后的卵母細(xì)胞活力降低，且經(jīng)冷凍保存的卵母細(xì)胞由于顆粒細(xì)胞層過早脫落而出現(xiàn)了透明帶硬化［12］。雖然透明帶硬化可以通過ICSI或透明帶鉆孔予以彌補(bǔ)，但令人擔(dān)憂的是冷凍-解凍后的卵母細(xì)胞的非整倍性有明顯增加。成熟卵母細(xì)胞停滯在第二次減數(shù)分裂的中期（MⅡ），而且非整倍性也有所增加，這可能是減數(shù)分裂紡錘體的解聚和重組以及相關(guān)染色體在冷卻和預(yù)熱過程中丟失的結(jié)果。另一種保存卵母細(xì)胞的替代方案是冷凍未成熟的卵母細(xì)胞，在卵母細(xì)胞再次減數(shù)分裂以前，即處于胚泡（GV）期時，將它們冷凍保存起來。在此時期，染色體仍被包裹在核膜里，不易發(fā)生染色體丟失。但這樣的卵母細(xì)胞在解凍后需要進(jìn)行體外成熟。人類GV卵母細(xì)胞不能很好地適應(yīng)冷凍保存，解凍存活的卵母細(xì)胞不到40%，且在這些存活的卵母細(xì)胞中，能達(dá)到體外成熟（MⅡ）的也不超過20%，囊胚的形成率也就更低了［13］。對于包裹著大量致密的卵丘細(xì)胞的GV期卵母細(xì)胞，很難找到最合適的冷凍保存方法，這可能就是造成上述結(jié)果的原因。

2.3 卵巢組織的冷凍保存和移植 對卵巢組織的冷凍保存研究始于20世紀(jì)50年代，將大鼠的卵巢經(jīng)冷凍-解凍后，再自體移植到去卵巢大鼠的皮下部位，以恢復(fù)其原有的內(nèi)分泌功能［14］。后來對綿羊（其卵巢形態(tài)與人類的相似）的研究重新引起了對常位自體移植作為恢復(fù)自然生育能力的方法的關(guān)注。由于卵巢體積過大而不能將其整體冷凍，所以只能以薄片或小塊的形式保存卵巢的皮質(zhì)組織。生長在卵巢皮質(zhì)部的主要是原始卵泡，與充分長大的卵母細(xì)胞相比，它們的一些特性可使它們免遭低溫?fù)p害。原始卵泡中的卵母細(xì)胞很小，停滯在第一次減數(shù)分裂前期，沒有透明帶和外周的顆粒細(xì)胞，并且只含有少量的低溫敏感脂類。一項組織學(xué)研究對冷凍-解凍的人類卵巢皮質(zhì)進(jìn)行活組織檢查，結(jié)果顯示其中的卵泡形態(tài)正常［15］。盡管冷凍保存的卵巢組織經(jīng)過解凍后，可以使大部分的（將近70%）原始卵泡得以復(fù)蘇［16］，但是以目前的培養(yǎng)水平，還不能維持原始卵泡在體外繼續(xù)生長到能夠受精的成熟狀態(tài)。不過，將卵巢皮質(zhì)組織植入免疫缺陷鼠的腎囊膜下，使卵泡發(fā)育到了有腔卵泡的階段的實驗獲得成功，則為冷凍-解凍的人類卵巢組織的長期培養(yǎng)提供了示范性的啟迪。理論上講，這些卵母細(xì)胞將被抽出，進(jìn)行體外成熟然后受精。盡管這種方法可以在保護(hù)瀕危物種、轉(zhuǎn)基因動物和珍稀品種方面得到成功應(yīng)用，但若用于治療人類的不孕不育，則會引發(fā)倫理道德上的問題。

2.4 人類卵泡和卵母細(xì)胞的體外發(fā)育 IVF前的卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)可以避免組織移植手術(shù)，而且可以減少女性在進(jìn)行超數(shù)排卵時對外源性促性腺激素的接觸（可能引發(fā)卵巢過度刺激綜合征），這項技術(shù)主要用于常規(guī)IVF。供卵也涉及激素刺激和取卵，使供卵過程對于捐獻(xiàn)者來說很難完成，因此造成供卵短缺。如果捐獻(xiàn)的是卵巢組織而不是卵母細(xì)胞，可能會有更多的女性愿意加入。重要的是，人類卵泡的體外生長（IVG）將會為早期卵泡發(fā)生機(jī)制的研究提供難得的機(jī)會。目前，人類卵泡的體外成熟技術(shù)正處于研究當(dāng)中，并且總體上借鑒了那些成功應(yīng)用于其他物種的方法。腔前卵泡通過酶分離和機(jī)械分離［17］后，進(jìn)行幾周的培養(yǎng)，一些卵泡就開始形成卵泡腔。來自胎兒卵巢的原始卵泡經(jīng)長期培養(yǎng)，可達(dá)到卵泡長大，卵母細(xì)胞成熟，甚至發(fā)生第一極體的排出。簡要地說，來自成人卵巢的原始卵泡最初還能在體外生長，但都活不過24 h，而且卵母細(xì)胞損失率一直很高［17］。

2.5 人類卵母細(xì)胞的體外成熟 第一例未成熟卵培養(yǎng)（IVM）嬰兒成功誕生于1983年［18］。類似的幾個報道相繼而來，包括自然周期或部分誘導(dǎo)周期婦女和多囊卵巢患者，經(jīng)卵母細(xì)胞IVM技術(shù)成功受孕且分娩［19］。當(dāng)卵母細(xì)胞被從小型有腔卵泡中取出并進(jìn)入體外培養(yǎng)，近60%的卵母細(xì)胞將會在48 h內(nèi)達(dá)到核成熟。與精子接觸后，又有約40%的卵母細(xì)胞能正常受精，出現(xiàn)兩個原核并排出第二極體。20%～25%的受精卵出現(xiàn)卵裂，但這些胚胎移植后的妊娠率卻沒有體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞形成的胚胎高，大多數(shù)胚胎都在4-細(xì)胞和8-細(xì)胞之間停止了發(fā)育。但是，Chian等［20］近來的報道認(rèn)為IVM后形成的胚胎也能獲得相似的妊娠率。一些因素可能會對IVM卵母細(xì)胞的受精、卵裂、囊胚形成及妊娠率造成影響，包括體內(nèi)或體外的激素環(huán)境和培養(yǎng)基的成分。對這些領(lǐng)域的進(jìn)一步研究，將會使人們更深入地了解卵母細(xì)胞成熟機(jī)制，進(jìn)而帶來移植率和妊娠率的提高。

3 小結(jié)

保存男女生育能力的新方法正在研究當(dāng)中，并很可能在未來的十年內(nèi)應(yīng)用于臨床。IVF和胚胎移植的妊娠率的持續(xù)走低似乎不可能使其達(dá)到自然受胎率的水平。但是，發(fā)展更好的胚胎篩選技術(shù)仍為達(dá)到自然受孕率帶來了最大希望，在更準(zhǔn)確地判斷和選擇有活力且遺傳正常的胚胎的同時，減少多胎妊娠帶來的生理、心理和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。解決人類不孕不育的新技術(shù)正在不斷的發(fā)展，但在過去的十年中，這些技術(shù)在沒有足夠的動物研究做基礎(chǔ)的情況下，就被盲目地用于臨床實踐，并試圖取得妊娠和活產(chǎn)的成功。年齡最大的IVF孩子才二十幾歲，最大的冷凍胚胎孩子才十幾歲，而最大的ICSI孩子還不到十歲。無法預(yù)知諸如ICSI的新技術(shù)是否會在未來幾年里對患者生育能力和人體健康造成不良影響，或許更重要的是，我們目前正熱衷的輔助生殖技術(shù)是否會對后代的生育能力及身體健康造成不良影響。