【摘要】 通過研究漢防己甲素（tetrandrine， Tet）對白血病細胞株K562及其耐藥細胞株K562/A02核因子κB（nuclear factorkappaB，NFκB）表達的影響，探討Tet逆轉多藥耐藥的作用機制。方法：采用免疫細胞化學及蛋白印跡法分別檢測1 μmol/L Tet作用K562和K562/A02細胞6 h和12 h后，細胞NFκB核轉位水平和胞核NFκB蛋白表達的變化。結果：Tet作用6 h和12 h后，對K562細胞的NFκB核轉位水平及胞核NFκB蛋白表達均無明顯影響(P>0.05)；K562/A02細胞NFκB核轉位水平及胞核NFκB蛋白表達明顯高于K562細胞對照組(P<0.01)；Tet作用6 h和12 h后，可明顯降低K562/A02細胞NFκB蛋白核轉位(P<0.05)和胞核NFκB蛋白表達水平（P<0.01)，作用12 h較作用6 h效果更顯著(P<0.05)。結論：1 μmol/L Tet可能通過抑制NFκB活化逆轉K562/A02細胞多藥耐藥性。

【關鍵詞】 白血病 多藥耐藥 防己甲素 核因子κB

Objective: To investigate the effects of tetrandrine (Tet) on nuclear factor kappaB (NFκB) expression in leukemia cell line K562 and multidrugresistant K562/A02 cell line.

Methods: The activations of NFκB in K562 and K562/A02 cells and the effects of 1 μmol/L Tet on NFκB expression were determined by immunocytochemistry and Western blot assay.

Results: Tet had no effect on NFκB expression in K562 cells after 6 and 12hour treatment (P>0.05)， and K562/A02 cells displayed higher level of NFκB protein expression than their parental K562 cells (P<0.01). Tet could significantly downregulate NFκB protein expression and nuclear translocation in K562/A02 cells shown by immunocytochemistry and Western blot， and this decrease became more significant after 12hour treatment than after at 6hour treatment (P<0.05).

Conclusion: Activation of NFκB may be related to multidrug resistance of K562/A02 cell line. And the inhibition of NFκB activation by Tet leads to multidrug resistance reversal in K562/A02 cell line.

Keywords: leukemia; multidrug resistance; tetrandrine; nuclear factor kappaB

腫瘤耐藥是當今腫瘤治療的一大難題，一直是國內外研究的熱點。腫瘤耐藥的發生是多種機制共同作用的結果，其機制之一是調節細胞凋亡相關因子導致凋亡抵抗，如活化NFκB、Bcl2、突變型p53等［1］。克服和干預腫瘤細胞耐藥是提高腫瘤療效的重要手段。中藥漢防己科植物粉防己具有行水和瀉下焦濕熱的功效，用于治療水腫臌脹、濕熱腳氣、手足痙攣等［2］。漢防己甲素（tetrandrine， Tet）是從粉防己塊根中提取的生物堿，研究證實Tet是天然的非選擇性鈣通道阻滯劑，又是鈣調蛋白拮抗劑，臨床用于逆轉多藥耐藥（multiple drug resistance， MDR）時耐受性較好，無明顯副作用［35］。核因子κB（nuclear factorkappaB，NFκB）是分布和作用十分廣泛的真核細胞轉錄調控因子，其與腫瘤發生發展、浸潤轉移以及腫瘤多藥耐藥有密切關系，可能成為提高腫瘤化療效果的治療新靶點［6］。

本課題組既往的實驗已證實，Tet能有效逆轉慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞耐藥株K562/A02對化療藥物柔紅霉素的耐藥性；它逆轉耐藥可能與下調mdr1基因及P糖蛋白（Pglycoprotein， Pgp）的表達，改變細胞內鈣離子濃度［Ca2＋］i，下調bcr/abl基因等有關［7， 8］。為進一步了解該藥逆轉耐藥的作用機制，本實驗將檢測Tet對NFκB表達的影響，為該藥作為耐藥逆轉劑應用于臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及來源 人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞株K562購自中國科學院上海細胞生物學研究所。人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變阿霉素（adriamycin， ADM）耐藥細胞株K562/A02購自中國醫學科學院血液病研究所。

1.2 主要儀器及試劑 免疫組化SP檢測試劑盒，為北京中山生物技術有限公司產品；蛋白提取試劑盒為Active Motif公司產品；蛋白質定量測定試劑盒為Pierce公司產品；Western blot試劑盒為KPL公司產品；中分子量標準蛋白質為Fermentas Life Science公司產品；βactin為Amresco公司產品；抗NFκB p65抗體（產品貨號：sc8008， sc372）及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG均為Santa Cruz公司產品。圖像分析處理系統：ImageMaster VDS圖像分析儀、ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件為Pharmacia公司產品。所有操作均按試劑盒說明書提供的方法進行。Tet注射液，30 mg/支（2 ml）為浙江康恩貝集團金華制藥廠產品。

1.3 細胞培養及實驗分組 K562細胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液培養，K562/A02細胞在含10％小牛血清、1 μmol/L ADM的RPMI 1640培養液中培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，每天換液，2～3 d傳代一次。實驗時取對數生長期細胞，用無血清RPMI 1640培養液靜置6 h后，計數活細胞數，活細胞數90％以上時進行分組及干預，細胞密度按不同實驗要求調整，實驗重復3次。K562細胞和K562/A02細胞分別分組，即分為K562細胞對照組、K562細胞Tet 6 h組、K562細胞Tet 12 h組和K562/A02細胞對照組、K562/A02細胞Tet 6 h組、K562/A02細胞Tet 12 h組。本實驗所采用的各藥物劑量均系本課題組既往實驗通過MTT法計算半數抑制濃度（50% inhibiting concentration， IC50）所得，其中1 μmol/L Tet為最佳有效逆轉濃度，該濃度無細胞毒作用，用于實驗。

1.4 NFκB核轉位免疫細胞化學染色及結果判斷 操作按試劑盒說明書提供的方法進行，3氨基9乙基咔唑（3amino9ethylcarbazole， AEC）顯色，PBS代替一抗作為陰性對照，以細胞核有紅色顆粒者為陽性細胞，鏡下隨機選取5個高倍視野，計數500個細胞，計算胞核染色的陽性細胞占細胞總數的百分比。

1.5 Western blot檢測NFκB 操作按試劑盒說明書提供的方法進行，以BCIP/NBT顯色，待出現清晰的蛋白條帶時，終止顯色反應。掃描濾膜并對電泳條帶進行光密度分析。以65 ku處NFκB蛋白條帶與βactin條帶的比值作為各組實驗數據，每組實驗重復3次。

1.6 統計學方法 數據資料用x±s表示，用SPSS 11.0統計軟件對數據進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSDt檢驗。

2 結 果

2.1 免疫細胞化學測定Tet對細胞NFκB蛋白核轉位的影響

2.1.1 Tet作用于K562細胞后免疫細胞化學結果 鏡下可見，K562細胞對照組細胞的胞漿、胞核均無著色，其余各組K562細胞胞漿均可見紅色顆粒沉淀，活化的細胞NFκB發生轉位進入胞核，胞核也可見紅色顆粒沉淀。Tet作用于K562細胞6 h和12 h后，細胞胞核NFκB陽性率分別為（37.39±0.95）%和（40.81±0.79）%，與K562細胞對照組（39.64±0.92）%相比，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.1.2 Tet作用于K562/A02細胞后免疫細胞化學結果 K562/A02細胞對照組NFκB陽性細胞百分率為（65.03±4.18）%，與K562細胞對照組相比，差異有統計學意義（P<0.01）。與K562/A02細胞對照組比較，Tet作用于K562/A02細胞6 h和12 h后，NFκB陽性細胞百分率均明顯減少，分別為（52.65±1.12）%（P<0.05）和（45.89±2.04）%（P<0.01）。Tet作用于K562/A02細胞12 h的陽性細胞百分率低于作用6 h組（P<0.05）。

2.2 Western blot測定Tet對細胞NFκB蛋白表達的影響

2.2.1 Tet作用于K562細胞后胞核NFκB蛋白表達 Tet作用于K562細胞6 h和12 h后，NFκB蛋白條帶與βactin條帶的比值分別為2.260±0.073和2.299±0.021，與K562對照組（2.366±0.241）相比差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2.2 Tet作用于K562/A02細胞后6 h胞核NFκB蛋白表達 各組NFκB蛋白條帶與βactin條帶的比值分別為：K562/A02細胞對照組3.545±0.219、K562細胞對照組2.366±0.241、K562/A02細胞Tet 6 h組2.528±0.196（圖1A）。K562/A02細胞胞核NFκB蛋白表達水平明顯高于K562細胞（P<0.01）；Tet作用于K562/A02細胞6 h后，胞核NFκB蛋白表達水平明顯低于K562/A02細胞對照組（P<0.05）。

2.2.3 Tet作用于K562/A02細胞12 h胞核NFκB蛋白表達 各組NFκB蛋白條帶與βactin條帶密度的比值分別為：K562/A02細胞對照組3.545±0.219、K562細胞對照組2.366±0.241、K562/A02細胞Tet 12 h組2.301±0.174（圖1B）。Tet作用于K562/A02細胞12 h后，胞核NFκB蛋白表達水平明顯低于對照組（P<0.01），與作用6 h相比，降低更明顯（P<0.05）。

3 討 論

體內外實驗已證實Tet逆轉耐藥作用［35］，但作用機制不清是限制其臨床應用的最大障礙，Tet逆轉耐藥機制是否與調節NFκB活性相關尚無報道。本研究表明K562/A02細胞NFκB表達水平高于K562細胞，Tet可降低K562/A02細胞NFκB蛋白表達。

K562及K562/A02細胞均存在NFκB活化，且K562/A02細胞NFκB活化高于K562細胞，提示NFκB活化與腫瘤發生及多藥耐藥形成有關，與近年國內外的相關報道一致［6］。Yeh等［9］用低劑量阿霉素誘導宮頸癌SiHa細胞的耐藥性，發現誘導耐藥的細胞SiHa/DR的NFκB活性明顯增加，并且抑制NFκB活性后，其耐藥性明顯減弱，提示化療藥誘導的NFκB活化是耐藥發生機制之一。Chuang等［10］研究多個腫瘤細胞株的NFκB活性，發現不同細胞的NFκB活性主要與其耐藥性相關。

Tet是否對K562和K562/A02細胞NFκB活性有影響未見報道。Chen等［11］用不同濃度的Tet與脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）或佛波醇酯（phorbol myristate acetate， PMA）共同作用于鼠巨噬細胞NR8383，發現Tet可抑制LPS或PMA誘導的NFκB活化，并呈劑量依賴性。Tet降低K562/A02細胞NFκB活性的機制不明。研究證實，Tet是一種鈣通道阻滯劑和抗氧化劑，而鈣通道路徑和細胞的氧化還原在NFκB活化中均起重要作用，Tet抑制NFκB活性可能與干擾鈣通道和（或）影響細胞的氧化還原狀態有關［3］。

研究表明，抑制NFκB活性可增加腫瘤細胞對化療的敏感性［12， 13］。史劍慧等［14］發現高三尖杉酯堿0.5 μmol/L可明顯誘導K562細胞NFκB活化，地塞米松1 μmol/L和長春新堿0.1 μmol/L均能顯著抑制高三尖杉酯堿誘導的NFκB活化，并增強其誘導K562n細胞凋亡的作用。

抑制NFκB活性，國外常用的方法是將ser32/36或lys21/22位突變的IκB導入腫瘤細胞，或者給予蛋白酶抑制劑使NFκB活化受阻，從而增加腫瘤細胞對化療的敏感性［15］。尋找安全有效的NFκB活化抑制劑對于克服腫瘤耐藥具有重要意義，Tet可抑制K562/A02細胞NFκB活性，不僅為其逆轉耐藥提供了理論依據，也為腫瘤耐藥的研究提供了思路。