【摘要】 目的應用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）技術，對甲氧西林耐藥溶血性葡萄球菌（MRSH）進行基因多態(tài)性研究。方法對81株MRSH通過RAPD技術進行擴增，電泳條帶采用SPSS 13.0軟件分析，根據(jù)樹狀圖分型。結果81株MRSH通過RAPD技術可產(chǎn)生相對固定的6條電泳帶，經(jīng)遺傳相關系數(shù)分析后可分為8型，其中A型占70.37%，而10株血培養(yǎng)陽性的MRSH中有9株為A型。 結論通過RAPD分型研究，可以了解MRSH基因流行型的特性，為該菌的感染控制提供分子流行病學依據(jù)。

【關鍵詞】 甲氧西林耐藥性 隨機擴增多態(tài)DNA技術 葡萄球菌屬

Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To investigate the polymorphism of the methicillin resistant staphylococci haemolyticus （MRSH）by Random Amplified Polymorphic DNA （RAPD） Technique. Methods Eighty one MRSH isolates were collected. The gene of MRSH were amplified by RAPD， the bands were analyzed by SPSS software， the dendrogram were used for cluster analysis. Results There were 6 stable bands produced by RAPD， according to which the 81 MRSH were classified into 8 genetypes. The A type got 70.37% of all isolates，and 9 of 10 MRSH which were isolated form blood were belong to A type. Conclusions RAPD asssy reveals the special epidemic genotypes of MRSH in hospital， which provides molecular epidemiological evidence for strategies to control MRSH infection.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ methicillin resistance;random amplified polymorphic DNA technique;staphylococcus

凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci， CoNS）長期以來被認為是定植于皮膚黏膜對人體無害的共棲菌[1]，但是隨著各種移植物的廣泛使用和其他侵襲性操作的增加，CoNS已經(jīng)成為醫(yī)院感染的重要病原菌[2]。溶血性葡萄球菌的臨床分離率在CoNS中僅次于表皮葡萄球菌。而甲氧西林耐藥溶血性葡萄球菌（Methicillin resistant sta-phylococci haemolyticus，MRSH）的多重耐藥情況則是CoNS中最嚴重的。多重耐藥的MRSH的流行，如果得不到及時的控制，其致死率高達18.8％～57.0％[3]。因此早期發(fā)現(xiàn)MRSH感染的流行非常重要。

隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplified Poly-morphic DNA，RAPD）技術又稱隨機引物PCR，是一種廣泛使用的分子流行病學技術，具有快速、操作簡便等特點。已經(jīng)被用于許多病原菌的分子流行病學研究。本次研究采用RAPD技術對臨床分離的MRSH作同源性分析，為控制MRSH感染流行提供基礎。

1資料與方法

1.1一般資料收集2002年4月至2003年4月浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院臨床分離的溶血性葡萄球菌81株。所有菌株均經(jīng)生物梅里埃公司API鑒定板重新鑒定，并重新測定MIC證實為MRSH[4，5]。81株菌株主要由移植病房、普外科病房、ICU等病房采集，其中移植病房分離株31株，ICU病房分離株27株，血培養(yǎng)陽性10株，痰培養(yǎng)陽性26株，引流液、腹水培養(yǎng)陽性45株。

1.2試劑和儀器藥敏板、LB培養(yǎng)基等購自杭州天和微生物試劑有限公司；DNA純化試劑盒Genomic DNA Purification Kit、Taq酶等（由上海申能博彩生物科技有限公司生產(chǎn)）；RAPD引物：ERIC1R 5`-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3`（由上海申工合成）；凝膠成像儀（由天津市科學器材公司生產(chǎn)BIO-RAD， 美國）；PCR儀（由西安賽亞科技有限公司生產(chǎn)Hybaid， 美國）。

1.3方法

1.3.1RAPD模板制備：細菌接種于2ml LB培養(yǎng)基中，35℃振蕩過夜，稀釋至4個麥氏單位，采用Genomic DNA Purification Kit抽提染色體DNA作為模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2反應體系及反應參數(shù)：采用25μl反應體系，反應混合物通過PCR儀擴增。反應參數(shù)：94℃預變性5 min，然后94℃ 45s，34.1℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)40次，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于1.0％凝膠電泳，0.5×TBE電泳液，100V，40mA條件下電泳50 min，溴化乙啶（Ethidium Bromide， EB）染色，凝膠成像儀拍照。

1.4統(tǒng)計學方法通過SPSS 13.0 軟件根據(jù)PCR電泳條帶不同及Jaccard遺傳相關系數(shù)分析，相似系數(shù)大于0.8視為同一型。

2結果

2.1通過RAPD可以擴增出14條條帶，結果見圖1。

由圖1可知，在500bp～2200bp之間，有6個固定條帶，分別位于750bp、830bp、940bp、1200bp、1600bp、1800bp。它將81株菌株分為了8型。A型共57株，包括4個亞型，A3亞型有31株，A1亞型有18株，A2亞有2株，A4亞有6株；B型有11株，B4亞型5株，B1亞型有3株，B2和B3亞型各有1株和2株；C型有8株；D型～H型各為1株。A型占全部菌株數(shù)的70%，主要由A1和A3兩個亞型組成，有爆發(fā)流行趨勢。

2.2血培養(yǎng)陽性菌株結果10株血培養(yǎng)陽性的MRSH菌株RAPD電泳圖譜見圖2，分型主要為A型，且都集中于血液科、ICU、移植病房[4]，見表1。

3討論

MRSH對絕大多數(shù)的抗菌藥物耐藥，雖然糖肽類抗生素中萬古霉素與去甲萬古霉素均無耐藥菌株，但敏感性已經(jīng)有所下降[4，5]。本次研究的81株MRSH對替考拉寧耐藥菌株13株，中介31株，共占總菌株數(shù)的54.3％，因此及早發(fā)現(xiàn)其流行并予以積極控制有重要意義。

本次研究中，大多數(shù)菌株均含有750bp、830bp、940bp、1200bp、1600bp、1800bp這6條條帶，RAPD-DNA帶譜類似，說明臨床分離的MRSH遺傳上比較接近，型與型之間的差異比較小。

本次研究中不同科室間各種分型沒有顯著差別，但在移植病房中與ICU均有較高分離率，也證明了在介入操作比較多的科室MRSH已經(jīng)成為了導致感染比較重要的病原菌。而普通病房中流行的MRSH分型與移植病房、ICU基本相同也說明了在科室與科室之間存在著基因型的定植傳播，MRSH感染病人、定植患者的流動是其主要傳播方式，而通過醫(yī)護人員為中介等傳播方式目前也被廣泛關注。

目前MRSH的醫(yī)院感染情況嚴重，治療藥物的選擇有限，已經(jīng)成為醫(yī)院感染常見致病菌。因此早期發(fā)現(xiàn)MRSH在院內(nèi)的流行，才能積極有效的對其進行控制，阻斷其進一步傳播。傳統(tǒng)的方法如噬菌體法分辨力低，分型的能力也較差。而脈沖電場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis ，PFGE）和RAPD都是研究MRSH分子流行病學的有力工具，但是PFGE需時長，對操作要求較高，無法及時得到所需的流行病學結果，而RAPD在反應體系及引物已經(jīng)確定的情況下，既可以隨時進行，又可以得到相對可靠的結果，因此可以作為判斷醫(yī)院感染流行的初篩工具。

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