【摘要】 目的:探討環孢菌素A(CsA)、漢防己甲素(Tet)及兩者聯合應用對人白血病耐藥細胞系K562/A02多藥耐藥的逆轉作用。方法：采用MTT法測定柔紅霉素(DNR)對細胞的半數抑制量(IC50)，流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞內DNR濃度。結果:DNR對K562細胞和K562/A02細胞IC50分別為0.27和21.22 mg·L-1;CsA（1 mg·L-1）及Tet（0.1 mg·L-1）單獨和聯合處理K562/A02后，DNR的IC50分別為7.83、5.32和2.32 mg·L-1;CsA和Tet對DNR作用K562的IC50無明顯影響；K562/A02細胞48 h凋亡率為2.19%，DNR(1 mg·L-1)作用K562/A02細胞凋亡率為2.70%，CsA和Tet單獨及聯合處理后凋亡率分別為10.27%、17.64%和52.79%；兩藥處理后細胞內化療藥物DNR濃度亦明顯增加。結論:CsA及Tet均可逆轉耐藥，且聯合作用逆轉效果更強。

【關鍵詞】 環孢菌素A; 漢防己甲素; K562/A02細胞; 多藥耐藥

化療是目前治療腫瘤的重要手段之一，而多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導致化療失敗的主要原因。P-糖蛋白(P-gp)介導的MDR是目前腫瘤MDR研究最多的主要機制之一，研究表明，其表達與細胞強大的藥物外排能力有關［1］。環孢菌素A(CsA)是一種免疫抑制劑，可調節P-gp的功能，抑制P-gp的過度表達，逆轉腫瘤細胞MDR［2］；漢防己甲素(Tetrandrine， Tet)是中藥粉防己塊根中的主要成分，是一種非特異性的Ca2+通道阻滯劑，研究表明它可以調節多種P-gp介導的MDR細胞株的耐藥［3］。兩種藥物單獨應用在體外實驗中得到了一定的逆轉耐藥效果，但聯合應用逆轉MDR國內外尚無相關報道。為了尋求有效低毒的聯合耐藥逆轉劑，為臨床治療白血病提供實驗室依據，我們以白血病細胞系K562及其耐藥細胞系K562/A02為實驗研究對象進行體外實驗，研究聯合應用以上兩種藥物對MDR的逆轉作用。

1 材料和方法

1.1 細胞系和培養條件

敏感株K562及MDR株K562/A02由中國醫學科學院血液學研究所提供，敏感細胞培養于含10%胎牛血清1640培養液中，K562/A02培養于含2 μmol·L- 1阿霉素、10 %胎牛血清1640培養液中，于實驗前1周停用阿霉素。兩種細胞均置于37 ℃、5%CO2培養箱中，2～3 d傳代1次。

1.2 實驗器材、藥物及試劑

LDZ522離心機(北京醫用離心機廠)，SartoriusBS110S天平(北京賽多利斯天平有限公司)，HZ28201K恒溫振蕩器(太倉市科教器材廠)，Model 550酶標儀(日本BIO2RAD公司)， FACSCAL BUR流式細胞儀(FCM，美國BD公司)，柔紅霉素（DNR，意大利Farmitalia公司），CsA (瑞士山德士公司)，Tet（江西銀濤藥業有限公司），四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司，用PBS配制成5 g·L-1），胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI 1640培養液(GIBCO公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 實驗時取對數生長期細胞，細胞密度按不同實驗要求進行調整:(1)對照組為K562或K562/A02細胞懸液;(2)DNR組為細胞懸液中加入一定劑量的DNR；(3)DNR加Tet組為細胞懸液中加入一定劑量的DNR和Tet；(4)DNR加CsA組為細胞懸液中加入一定劑量的DNR和CsA；(5)DNR加Tet加CsA組為細胞懸液中加入一定劑量的DNR、Tet和CsA。

1.3.2 MTT法測定逆轉劑對DNR細胞毒性影響 參照文獻及試劑盒說明進行。取對數生長期的耐藥株和敏感株細胞，加入逆轉劑(單用或聯合，CsA終濃度1 mg·L-1，Tet終濃度2.5 mg·L-1)作用1 h，按所設梯度加入不同濃度DNR，每個濃度設3個復孔。血清培養液為調零孔組，不加藥的細胞懸液為空白對照組，接種于96孔板，每孔含2×105個細胞懸液200 μl。置于37 ℃、5% CO2 培養箱孵育48 h后取出，加MTT反應液20 μl，繼續培養4 h后于平板離心機上3 000 r·min-1離心10 min，棄上清，每孔加150 μl二甲亞砜溶解，微量振蕩器混勻，酶標儀上測定540 nm波長的吸光度(A)。計算細胞的生長抑制率:

生長抑制率(％)=(1-實驗孔A值/對照孔A值)×100%。

IC50 = 細胞生長抑制率為50%時的藥物濃度

耐藥倍數= 耐藥細胞IC50/ 敏感細胞IC50

實驗重復3次，每次設3個復孔，取平均值為最終結果。

1.3.3 FCM檢測細胞凋亡率 取K562/A02細胞，終濃度2×105 ml-1，根據實驗分組分別加藥(單用或聯合，DNR終濃度1 mg·L-1，CsA終濃度1 mg·L-1，Tet終濃度0.1 mg·L-1)，另設K562/A02對照組和只加DNR（1 mg·L-1）的K562/A02細胞對照組，分別孵育48 h后收集細胞，用4 ℃預冷的PBS洗滌兩次，用1 ml blot buffer重懸細胞，各加入AnnexinⅤ-FITC 10 μl，另外設空白對照和FITC對照，常溫避光15 min，洗滌細胞后在FCM上檢測細胞凋亡情況。

1.3.4 FCM檢測細胞內DNR濃度 取K562/A02細胞株，終濃度2×105 ml-1，分組加藥，分別孵育48 h，另設K562細胞及不加逆轉劑K562/A02細胞對照組，分別加入DNR(終濃度1 mg·L-1)，置于37 ℃、5%CO2培養箱孵育2 h，冷PBS液洗3次，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，用FCM測定細胞內DNR相對熒光強度，此值與DNR濃度成正比。

1.4 統計學處理

運用SPSS 13.0統計軟件進行分析，顯著性檢驗采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 CsA和Tet的濃度選擇

CsA<5 mg·L-1、Tet<1 mg·L-1時對K562細胞無明顯毒性，抑制作用不顯著，故選擇CsA 1 mg·L-1、Tet 0.1 mg·L-1作為實驗濃度。

2.2 逆轉劑處理前后DNR對K562和K562/A02細胞的毒性作用DNR對K562/A02細胞和K562細胞的IC50分別為21.22和0.27 mg·L-1，耐藥倍數為79。用CsA（1 mg·L-1）處理后， DNR對K562 /A02細胞的IC50為7.83 mg·L-1，逆轉倍數為2.71。Tet(0.1 mg·L-1)處理K562 /A02細胞后DNR IC50為5.32 mg·L-1，逆轉倍數為3.39。兩藥聯合對DNR作用K562 /A02細胞的IC50值為2.32 mg·L-1，逆轉倍數為9.11。逆轉劑對K562 /A02細胞的DNR毒性有明顯影響(P<0.01，表1)。CsA（1 mg·L-1）處理后，DNR對K562細胞的IC50值為0.26 mg·L-1;Tet(0.1 mg·L-1)處理K562細胞后DNR的IC50為0.25 mg·L-1；兩藥聯合對DNR作用K562細胞的IC50值為0.28 mg·L-1。逆轉劑對DNR作用K562細胞的細胞毒性無明顯影響(P>0.10，表2)。表1 DNR分別聯合CsA和Tet及三藥聯合對K562/A02細胞毒性作用表2 DNR分別聯合CsA和Tet及三藥聯合對K562細胞毒性作用

Annexin Ⅴ凋亡情況見圖1。

圖1 不同藥物及藥物聯合處理后K562/A02細胞的凋亡率（48 h，Annexin Ⅴ法）

2.4 FCM檢測細胞內DNR濃度

未加逆轉劑的K562/A02耐藥株細胞內DNR相對熒光強度為103，而K562敏感株為522，前者是后者的19%，K562/A02經CsA(1 mg·L-1)、Tet(0.1 mg·L-1)及CsA(1 mg·L-1)加Tet(0.1 mg·L-1)聯合作用48 h， 細胞內DNR熒光強度分別為310、339和515，分別為K562敏感株的60%、65%和98%。CsA處理組、Tet處理組及CsA 聯合Tet處理組，細胞內DNR濃度均增加，兩藥聯合組增加顯著，與K562/A02對照組間有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

腫瘤MDR的產生是多種因素共同作用的結果，目前研究表明，最主要的有以下幾個方面：(1)促進腫瘤細胞內藥物外排機制，包括 P-gp、多藥耐藥相關蛋白、肺耐藥蛋白、乳腺癌耐藥蛋白等ATP超家族介導的MDR，它們具有細胞膜離子“泵”樣作用，可以將細胞內的藥物“泵”到細胞外，使細胞內藥物濃度降低從而產生耐藥［4-6］。(2)酶類介導的MDR，包括糖基化神經酰胺合成酶、拓樸異構酶Ⅱ、谷胱苷肽S轉移酶-π、磷酸激酶C等［7-9］。(3)細胞凋亡基因介導的MDR，包括p53基因突變、bcl-2原癌基因過表達等［10］。(4)其他，包括腫瘤細胞抗凋亡能力增強，DNA修復功能增強和微環境耐藥(microenvironment resistance)等［11］。其中，P-gp過表達是腫瘤MDR中研究得最為廣泛和深入的機制之一，成為臨床克服多藥耐藥主要的靶點和觀察指標。

國內外眾多實驗室通過研究發現了多種MDR逆轉劑，如鈣離子通道阻滯劑、鈣調蛋白抑制劑、親脂性化合物、蛋白激酶C抑制劑、免疫抑制藥物等，能克服腫瘤臨床耐藥和提高化療療效。但這些耐藥逆轉劑在臨床上卻存在著對心血管系統的副作用、免疫抑制作用、肝腎毒性，或在耐受劑量下逆轉活性不高等不足。目前，聯合使用逆轉劑已成為耐藥逆轉研究的發展趨勢。合理使用不同作用機制、毒副反應無疊加的兩種或多種耐藥逆轉劑不但可起到協同增敏作用，而且可降低單一逆轉藥物劑量， 減少副作用， 提高耐受性［12］。

本實驗以尋求低毒高效的聯合逆轉劑為目的，對CsA和中藥Tet共同作用逆轉MDR進行體外研究。通過MTT預實驗，CsA在5 mg·L-1及以下濃度、Tet在1 mg·L-1 及以下濃度， 對K562細胞系及K562/A02細胞系均無直接細胞毒性，我們選用1 mg·L-1 CsA和0.1 mg·L-1 Tet時發現，兩藥不能增強化療藥物DNR對K562細胞系的殺傷作用，但能明顯增強DNR對K562/A02細胞系的殺傷作用。本研究顯示，CsA及Tet均可以增加白血病細胞的凋亡率，同時可以明顯增加細胞內DNR的濃度，并且兩藥聯合時作用更強，為臨床聯合應用耐藥逆轉劑提供了理論依據?？傊幬锏穆摵蠎媚孓D白血病細胞MDR，既可減少藥物的毒副作用，又增強了逆轉效果，它具有廣闊的臨床應用前景。

［2］HE L，LIU G Q. Interaction of multidrug resistance reversal agents with P-glycoprotein ATPase activity on blood-brain barrier［J］. Acta Pharmacol Sin， 2002， 23:423-429.

［3］LI J，XU L Z， HE K L， et al. Reversal effects of nornegestrol acetate on multidrug resistance in adriamycin-resistant MCF J breast cancer line［J］. Breast Cancer Res， 2001，3 (4):253.

［4］SCHDERT T， KURBOCHER C M. Induction of MDR1 gene expression by antieoplatic agents in ovarin cancer cell lines［J］.Anticancer Res， 2002， 22 (4):2199-2202.

［5］GOTTESMAN M M. Mechanisms of cancer drug resistance［J］. Annu Rev Med， 2002， 53 (1):615-627.

［6］程堅，陳寶安.白血病多藥耐藥相關基因臨床研究新進展［J］.東南大學學報:醫學版，2007，26(3):225-229.

［7］李江濤，彭淑牖，劉穎斌，等.糖基化神經酰胺合成酶及相關基因的表達與人膽囊癌多藥耐藥［J］.中華普通外科雜志，2005，20(6):382-383.

［8］SCOTTO K W. Transcriptional regulation of ABC drug transporters［J］.Oncogene， 2003， 22 (17):7496-7511.

［9］TSURUO T， NAITO M， TOMIDA A， et al. Molecular targeting therapy of cancer:drug resistance， apoptosis and survival signal ［J］. Cancer Sci， 2003， 94 (1):15-21.

［10］GADDUCCI A， COSIO S， MURACA S， et al. Molecular mechanisms of apoptosis and chemosensitivity to platinum and paclitaxel in ovarian cancer:biological data and clinical implications［J］. Eur J Gynaecol Oncol，2002，23(5):390-396.

［11］GRANDGIRARD N， LY-SUNNARAM B， FERANT D， et al. Impact of Topoi-somerase Ⅱ alpha and spermine on the clinical outcome of children with acute lymphoblastic leukemia［J］. Leuk Res， 2004，28:479-486.

［12］NOOTER K， SONNEVELD P， OSTRUM R， et al. Overexp ression of the mdr-1 gene blast cell from patients with acute myelocytic leukemia is associated with decreased anthracycline accumulation that can be restored by cyclosporine A［J］. Int J Cancer， 1990，45:263-270.