【摘要】 目的：建立人腺樣囊性癌耐藥細胞系，為闡明腺樣囊性癌的多藥耐藥機制及逆轉耐藥提供模型及研究依據。 方法：以長春新堿（VCR）為誘導劑，通過濃度遞增間斷刺激法對人腺樣囊性癌細胞系（ACC）進行體外誘導耐藥，建立耐VCR的腺樣囊性癌細胞系ACC/VCR。細胞計數法繪制細胞生長曲線，噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞對化療藥物敏感性。 結果：ACC經體外誘導后，ACC/VCR細胞對長春新堿（VCR）、阿霉素（ADM）和平陽霉素（PYM）的耐藥性明顯增強，具有交叉耐藥，對環磷酰胺（CTX）、氟尿嘧啶（5-FU）和順鉑（DDP）耐藥性無明顯變化。耐藥前后ACC細胞的生長曲線、群體倍增時間和光鏡下的形態無明顯改變。結論：VCR可誘導腺樣囊性癌細胞產生多藥耐藥。

【關鍵詞】 腺樣囊性癌多藥耐藥長春新堿

Establishment of multidrug cell line of human adenoid cystic carcinoma

Abstract AIM: To establish an in vitro resistance model of adenoid cystic carcinoma which can provide theoretical information for elucidating the mechanisms of multidrug resistance (MDR)， improving the chemotherapy scheme， evaluating the prognosis and reserving the MDR in adenoid cystic carcinoma.METHODS: The resistance cell line， ACC/VCR， was induced in the ACC cell line in vitro by progressive concentrations of vincristine (VCR)， a drug of choice in the treatment of adenoid cystic carcinoma. The growth curve， drug sensitivity in the parental and resistant cell lines were investigated by cell counting and MTT assay. RESULTS: ACC/VCR cell line was cross-resistant to vincristine (VCR)， adriamycine (ADM) and pingyangmycin (PYM)， but not resistant to Cyclophosphamide (CTX)， fluorouracil (5-FU) and cisplatin (DDP). There was no significant difference in the doubling time and morphological changes between ACC cell line and ACC/VCR cell line. CONCLUSION: Exposing to VCR can induce MDR in adenoid cystic carcinoma.

· KEYWORDS: adenoid cystic carcinoma; multidrug resistance; vincristine

Zhou XD， Song GX， Sui ZF， Chang JW. Establishment of multidrug cell line of human adenoid cystic carcinoma. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ，2007;7(2):417-419

0引言

腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是一種高度惡性的上皮性腫瘤，可發生于全身各部位，如涎腺、頜下腺、氣管、肺、乳腺、皮膚等，于眼眶則好發于淚腺[1]。目前對腺樣囊性癌的治療以綜合治療為主，其中化療主要作為新輔助化療（術前或放療前化療）、輔助化療（手術后或放療后化療）、放療增敏劑和姑息性化療應用[2]。有的腫瘤細胞在對一種化療藥物耐藥的同時，對其他結構和機制不同的化療藥物也產生耐藥性，稱為腫瘤細胞的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR) [3]。多藥耐藥的產生是導致腫瘤產生耐藥和化療失敗的重要原因之一。我們通過長春新堿誘導建立腺樣囊性癌耐藥細胞系，旨在為闡明腺樣囊性癌的多藥耐藥機制，指導多藥耐藥逆轉劑的研究提供模型和研究依據。

1材料和方法

1.1材料 人腺樣囊性癌(ACC)細胞系購自上海申能博彩公司。RPMI1640干粉培養基(Gibco公司)，胎牛血清(天津灝陽生物有限公司，56℃40min滅活補體)，青、鏈霉素(石家莊制藥廠)，谷氨酰胺（L-glutamina）(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，依地酸二鈉（EDTA）(廣州化學試劑廠)，二甲基亞砜（DMSO）(北京鼎國生物有限公司)，噻唑藍（MTT）(北京鼎國生物有限公司)，長春新堿（vincristine，VCR）(上海華聯制藥有限公司)，環磷酰胺(CTX)(上海華聯制藥有限公司)，阿霉素(adriamycin，ADM)(深圳萬樂藥業有限公司)，氟尿嘧啶(5-FU)(天津市氨基酸公司人民制藥廠)，平陽霉素(PYM)(天津太河制藥有限公司)，順鉑(DDP)(山東齊魯制藥廠)。CO2培養箱（Heraeus，德國），倒置顯微鏡（Olympus-1M，日本），生物顯微鏡 （Olympus BH-2，日本），紫外分光光度計（UV754，上海分析儀器廠），臺式高速離心機（Allegra64R，美國Beckman），磁力攪拌器（江蘇省金壇市通濟儀器廠），酶聯儀（DG-3022A，南京電子管廠）。

1.2方法 ACC細胞系培養在含100ml/L滅活胎牛血清、100kU/L青、鏈霉素的RPMI1640培養液中。培養條件：37℃，50ml/L CO2，每3d換液1次，2.5g/L胰酶、0.2g/L EDTA消化傳代，約5d傳代1次。采用VCR濃度遞增間斷刺激法選擇耐藥細胞，具體步驟如下：VCR 15μg/L×7d，去藥7d，VCR 30μg/L×7d，去藥7d，VCR 60μg/L×7d，去藥7d，VCR 60μg/L×7d，去藥7d，VCR 120μg/L×7d，去藥7d，VCR 120μg/L×7d，去藥7d，VCR 250μg/L×7d，去藥7d，VCR 250μg/L×7d，去藥7d，無藥培養7d后進行實驗。取生長狀態良好的細胞，2.5g/L胰酶、0.2g/L EDTA消化制成細胞懸液，計數，將細胞懸液接種于24孔板，每孔1mL，接種濃度1×107/L，37℃，50ml/L CO2培養。每日取3孔板細胞進行計數，計算均值。連續觀察7d，其間培養3d后給未計數的細胞換液。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸（對數），在半對數坐標紙上繪制生長曲線，根據公式計算細胞在對數生長期的倍增時間。TD(倍增時間) = t（培養時間h）×lg2/（lgNt-lgN0）。N0，Nt：接種后及培養t h后的細胞數。MTT比色實驗[4]測定化療藥物敏感性：取對數生長期細胞，2.5g/L胰酶、0.2g/LEDTA消化，用含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培養液配成5×106～1×107/L的單個細胞懸液；取96孔培養板，每孔加入200μL細胞懸液，37℃，50 ml/L CO2培養過夜；更換培養液，并按一系列濃度（終濃度分別為0.01，0.1，1，10，100、1 000 mg/L）加入抗腫瘤藥物，每濃度重復3孔，以不加細胞只加培養液的孔作為空白對照，37℃，50 ml/L CO2培養72h；每孔加5g/L MTT溶液20μL，37℃，50 ml/L CO2繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩10min，使其充分溶解；選擇490nm波長，在酶聯儀上測定各孔吸光度（A ）；按公式計算細胞存活率，以細胞存活率對藥物濃度對數作圖，求出藥物半數抑制濃度（IC50），計算耐藥系數（resistance factor，RF）。細胞存活率（%）=試驗組吸光值A /對照組吸光值A×100%，RF=耐藥細胞IC50/親代細胞IC50。

2結果

2.1細胞系的建立 ACC細胞系經VCR體外誘導篩選，連續培養4mo，獲得了在250μg/L VCR作用下生長良好的耐藥細胞系。命名為ACC/VCR。無藥培養2mo，對VCR的耐藥指數無明顯下降，說明已有穩定的耐藥性。VCR在體外誘導耐藥的培養過程中，加藥后細胞出現腫脹，胞漿內顆粒較粗，細胞生長受抑，增殖速度很慢甚至不增殖，隨之大量脫壁、數目減少。換用不含VCR的培養液培養，并適當延長傳代周期，存活下來的耐藥細胞生長分裂加快，形成多個細胞克隆，再逐漸融合成片，但細胞大小不一，排列紊亂，異型性較為明顯。然后繼續用含VCR的培養液篩選。經過幾次篩選后，不耐藥或耐藥性低的的細胞被排除，余下的是有較高抗藥性的細胞。

2.2細胞形態學觀察 ACC和ACC/VCR細胞在體外均為貼壁生長，在倒置顯微鏡下為多角形上皮樣細胞，大小較為一致，胞質內可見透亮度深淺不等的顆粒，核大，類圓形或不規則形，核/質比例高，核仁2～3個，清晰可見的，并可見巨大融合細胞。細胞分裂相多見，并有多級核分裂，排列緊密時細胞互相鑲嵌成鋪路石樣，密度再增高時可重疊生長，表現為接觸抑制消失（圖1A，B）。ACC和ACC/VCR細胞在體外增殖速度相似（生長曲線見圖2）。群體倍增時間分別為28.32±1.65h和27.55±0.89h，兩組間比較無顯著性差異（t =1.162，P =0.311）。

2.3耐藥譜 ACC/VCR不僅對原誘導藥物VCR具有耐藥性，而且對ADM，PYM有交叉耐藥性（表1）。各種化療藥物臨床常用量所達血藥濃度分別為：VCR 0.25mg/L；CTX 140mg/L；ADM 6mg/L；5-FU 50mg/L；PYM 20mg/L；DDP 5mg/L。

3討論

近年的研究發現，腫瘤細胞一般多對天然植物堿及其人工半合成衍生物類(如長春新堿、長春花堿、秋水仙堿等、鬼臼乙叉甙等)和抗生素類(如阿霉素、放線菌素Ｄ、柔紅霉素、光神霉素等)藥物易產生耐藥和交叉耐藥，而且不同組織來源的腫瘤其發生多藥耐藥的機制亦各不相同[5]。對MDR的研究對于改善腫瘤患者預后，制定合理的治療方案以防止MDR出現或逆轉MDR有重要意義。體外建立耐藥細胞系國內外均見報道，常用的方法是濃度遞增間斷刺激法[6，7]，即通過在體外培養的親代細胞中逐漸增加某一種化療藥物的濃度，通過藥物選擇作用獲得耐藥細胞系，為體外研究多藥耐藥提供模型。當然，藥物在體內的代謝和作用過程遠比體外復雜，不應單純進行體外實驗而忽視對臨床標本的研究。

有關人ACC細胞體外實驗的研究目前國內外多有報道，現已建立有SACC83，ACC-M等細胞系，并進行了一系列有關藥物敏感性測試、放射治療、生物治療等方面的實驗研究[8，9]。但是，體外環境遠不如體內復雜，而且在體外培養過程中，腫瘤細胞的某些生物學特性可能會發生變化，與實際的過程可能有一定出入，因此體外實驗得出的結論有時并不能完全解釋腫瘤在機體內的生物學行為和病理過程。作為腫瘤細胞，ACC為無限細胞系，在體外可無限傳代生長，但培養過程中失去了原有的腺管樣排列結構，鋪成片狀，接近于實性型的細胞排列結構。我們以長春新堿為誘導劑，通過濃度遞增間斷刺激法在體外對ACC細胞系進行篩選和誘導耐藥，建立了耐VCR的腺樣囊性癌細胞系ACC/VCR。VCR是目前ACC化療中最常使用的藥物之一，也是化療藥物中最易產生耐藥的一種。目前國內外多有建立腫瘤耐藥模型的報道，VCR是最常使用的藥物之一，濃度遞增間斷刺激法是最常見的誘導方法，它與臨床上化療藥物的使用具有一定相似之處[6]。通過在體外建立耐藥模型，可對腫瘤多藥耐藥機制進行研究，用于解釋腫瘤在體內發生耐藥的機制，還可以為耐藥逆轉劑的研究提供基礎。 ACC和ACC/VCR細胞在生長曲線及群體倍增時間上無明顯變化，在倒置顯微鏡下，細胞形態學亦無明顯變化。但有研究表明，在電鏡下親代細胞和耐藥細胞存在形態學變化。Prados等[10]在研究以放線菌素D（DAC）為誘導劑建立的橫紋肌肉瘤耐藥細胞系時發現，電鏡下耐藥細胞出現胞質內肌絲成分聚集、細胞器增多、雙葉核等改變，細胞形態學的變化主要體現在超微結構上。

惡性腫瘤的藥物敏感性研究一直是腫瘤治療學研究中的熱門問題，準確快速的腫瘤化療藥敏檢測對指導臨床選擇化療藥，提高療效具有重要意義[11，12]。但目前主要集中在實驗室研究，真正進入臨床前瞻性研究，指導臨床治療的還很少，尤其是在國內，尚未見進行臨床試驗的報道。目前對于ACC化療效果的臨床研究看法不一，對于化療方案的選擇差異很大。這可能與腫瘤的生物學特性（組織學分型、分化程度和細胞動力學等）、患者的個體差異（對化療藥物的敏感度和耐受程度）、藥物本身的毒性反應等有關。在臨床上常常使用同一種化療方案治療同一種腫瘤的不同患者甚至是患有不同腫瘤的患者，這顯然是不科學的，針對不同患者進行腫瘤藥物敏感試驗以選擇有效的化療藥物，制定個體化的化療方案，才是今后化療的發展趨勢。我們選取的6種化療藥物，作用機制各不相同，且均是目前臨床上比較常用的用于治療ACC的化療藥物[13]。自1983年Mosmann首先利用MTT研究瘤細胞生存狀況以來，MTT法藥敏試驗迅速建立并得到發展[4]。其染色劑是一種能接受氫原子的染料，化學名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑嗅鹽(3-(4，5-dimethylthiazol-2)-2，5-diphenyltetrazo－diumbromide，MTT)，商品名噻唑藍，簡稱為MTT。MTT法的特點是靈敏度高、快速、簡便、經濟，不需放射性同位素，結果重復性好，并可同時對多種藥物進行篩選和觀察，可適用于所有腫瘤類型，目前美國國立癌癥研究所已將其作為篩選化療藥物的常規手段。我們采用MTT法進行體外藥物敏感性試驗，結果顯示，由親代細胞誘導得來的耐藥細胞ACC/VCR不僅對VCR耐藥，而且對ADM，PYM發生了交叉耐藥。這與目前研究認為多藥耐藥多見于天然來源的化療藥物的觀點相符。通過MTT試驗我們發現，化療藥物常規臨床用量所達到的血藥濃度多數對腫瘤細胞增殖達不到有效的抑制作用，然而通過無限制增加藥物用量以達到殺滅腫瘤細胞目的的做法只可用于體外實驗，在臨床上盲目增大化療藥用量會大大增加對人體的毒副作用，甚至可能帶來致命的后果。解決的辦法有兩個，一是通過逆轉耐藥劑的研制，增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，以減少用藥量，減輕毒副作用；二是研發全新的藥物劑型，使藥物具有靶向性和緩釋性的特點，腫瘤組織局部可以達到有效血藥濃度而外周血藥物濃度很低。例如，研制全新的多藥耐藥逆轉劑，針對已知多藥耐藥相關基因進行基因治療逆轉耐藥[14]，以及用具有緩釋作用的納米粒子包裹化療藥物進行主動靶向治療的研究[15]，都會是今后化療研究的新熱點。

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