【關(guān)鍵詞】 結(jié)核分支桿菌；rPOB基因；KatG基因；rpsL基因；SSCP；藥物耐受性

Studies of Mycobacterium tuberculosis multi-drug resistant gene

【Abstract】 Objective To evaluat the importance of rPOB、KatG and rpsL gene mutation detection in multi-drug resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Methods rPOB、KatG and rpsL gene mutation of 54multi-drug resistant clinical isolates，which is INH RFP and Sm resistance and 54 drug susceptible strains were analyzed using polymerase chain reaction-single strand conformation (PCR-SSCP).Results SSCP pattern of H37RV strain as control，SSCP pattern of rPOB，rpsL PCR amplification from drug susceptible strains were all the same as control. The specificity was 100%. However，the different SSCP pattern of KatG gene were found in 2 susceptible strains. The specificity was 96.3%. Gene deletion of rPOB、KatG and rpsL were not found in all clinical isolates tested. SSCP patterns of rPOB gene were different from control in 49 drug resistant clinical isolates. SSCP patterns of KatG gene were different from control in 32drug resistant clinical isolates，SSCP pattern of rpsL gene were different from control in 40 drug resistant clinical isolates. The sensitivity were 90.1% (rPOB)，59.3% (KatG) and rpsl (74.1%)，respectively. Conclusion The major mechanism of RFP，INH，SM resistant drug was rPOB、KatG and rpsL gene mutation，respectively PCR-SSCP may be one of the way which applied to drug resistant detection of Mycobacterium tuberculosis.

【Key words】 Mycobacterium tuberculosis；rPOB gene；KatG gene；rpsL gene；SSCP；drug tolerance

我國是結(jié)核病疫情最嚴(yán)重的國家之一，其主要原因是耐藥（DR-TB）和耐多藥（MDR-TB）結(jié)核病的廣泛分布和迅速傳播。由于單藥化療和不規(guī)則化療，其耐藥情況越來越嚴(yán)重。近年來隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展人們對抗結(jié)核分枝桿菌的藥理作用位點和結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制，尤其是耐異煙肼、利福平和鏈霉素。目前，結(jié)核分支桿菌耐藥性測定仍多采用絕對濃度法、比例法等經(jīng)典方法。但由于結(jié)核分支桿菌生長緩慢，而耐藥結(jié)核分支桿菌生長更為緩慢，其耐藥性測定需6～8周甚至更長，不能及時指導(dǎo)臨床用藥。新進(jìn)開展的Bactec法藥敏檢測因其價格昂貴等諸多不便限制了其廣泛使用。據(jù)報道［1］INH耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因（KatG）有關(guān)、而某些結(jié)核分支桿菌耐SM的產(chǎn)生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因（rpsL）和16SrRNA編碼基因（rrs）突變所致［2］，同時也證實了結(jié)核分支桿菌耐利福平與RNA聚合酶的β亞基的編碼基因rPOB的突變有關(guān)［3］。筆者采PCR-SSCP銀染法對54例（同時耐INH、RFP、SM）和45例（藥物敏感）肺結(jié)核病人痰標(biāo)本臨床分離株同時進(jìn)行KatG基因、rPOB基因和rpsL基因突變分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 H37RV標(biāo)準(zhǔn)株來源于中國藥品生物制品檢定所，45例敏感株和54例同時耐INH、RFP、SM的臨床分離株來自珠海市人民醫(yī)院、沈陽市胸科醫(yī)院等。按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗證實為結(jié)核分支桿菌，耐藥株則同時對異煙肼、利福平、鏈霉素耐藥。藥物的最高濃度為異煙肼10mg/L、利福平250mg/L、鏈霉素100mg/L。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA制備 臨床分離株DNA用常規(guī)酚/氯仿提取，并將純化后的提取物置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用25μl反應(yīng)體系，4xdNTPs終濃度為0.2mmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，置DNA擴(kuò)增儀擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測rPOB出現(xiàn)258bp條帶、KatG出現(xiàn)282bp條帶、rpsL出現(xiàn)267bp條帶即為擴(kuò)增陽性。

1.2.3 SSCP銀染 PCR擴(kuò)增陽性的標(biāo)本進(jìn)行SSCP檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物加等量甲酰胺變性液95℃變性10min，立即冰浴5min，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，條件為6℃、100V電壓，電泳約2～3h，電泳結(jié)束后，取凝膠板行硝酸銀染色，觀察結(jié)果并照相。

2 結(jié)果

(1)PCR擴(kuò)增以結(jié)核分支桿菌H37RV標(biāo)準(zhǔn)株DNA為對照。45株藥物敏感株和54株耐多藥臨床分離株KatG、rPOB和rpsL基因均擴(kuò)增成功。

(2)45株結(jié)核分支桿菌敏感株rPOB和rpsL基因PCR擴(kuò)增片段SSCP圖譜與H37RV株相比均未發(fā)現(xiàn)異常，特異性為100%。KatG基因擴(kuò)增片段SSCP有2株與H37RV相比泳動異常，特異性為95.6%。54株同時耐INH、RFP和SM的臨床分離株中，與H37RV相比，KatG基因32株泳動異常，22株無改變；rPOB基因49株泳動異常，5株無改變；rpsL基因40株泳動異常，14株無改變，SSCP檢測KatG基因、rPOB基因、rpsL基因的陽性率分別為59.3%、90.1%和74.1%。（見表1）表1 結(jié)核分支桿菌KatG、rPOB、rpsL基因擴(kuò)增及 SSCP結(jié)果注：a．SSCP圖譜與H37RV有差異

3 討論

筆者采用PCR-SSCP技術(shù)分析了54株同時耐異煙肼、利福平和鏈霉素的多耐藥臨床分離株及45株臨床敏感株的KatG、rPOB和rpsL基因突變。結(jié)果表明：多耐藥臨床分離株SSCP，KatG突變率為59.3%，藥物敏感株有4.4%的突變率。rPOB突變率為90.1%，rpsL突變率為74.1%，兩者藥物敏感株均無改變。表明結(jié)核分支桿菌異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG有關(guān)，KatG基因在INH耐藥中起主導(dǎo)作用。最近的研究結(jié)果表明，大多數(shù)的耐SM的產(chǎn)生是由于核糖體蛋白S12編碼基因（rpsL）或16SRNA編碼基因（rrs）突變所致。本文有72.2%的結(jié)核分支桿菌耐SM臨床分離株有SSCP泳動異常，表明其rpsL基因發(fā)生了突變，這與Morris等的結(jié)果相似［2］。由此可見rpsL基因突變是結(jié)核分支桿菌耐SM臨床分離株最常見的基因突變。但有一部分耐INH株未檢測到KatG缺失或突變，提示某些菌株的耐INH形成可能與KatG無關(guān)。如inhA基因、ahpC基因也與INH耐藥有相關(guān)性［4，5］，INH耐藥機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。據(jù)國內(nèi)外報道［6，7］耐RFP結(jié)核分支桿菌rPOB基因突變的發(fā)生率為92.7%～97.6%，敏感株無突變。這與本文的結(jié)果相近，表明結(jié)核分支桿菌耐利福平與RNA聚合酶的β亞基的編碼基因rPOB有關(guān)，rPOB突變已成為結(jié)核分支桿菌耐RFP的主要遺傳指標(biāo)。在耐INH、RFP和SM結(jié)核分支桿菌中，有60%左右同時有INH、RFP和SM遺傳標(biāo)志改變，20%～30%有2種耐藥遺傳標(biāo)志改變，10%～20%只有rPOB點突變。說明75%以上耐多藥分離株是各種藥物靶分子的編碼基因突變所致。同時有報道［6］90％～95%的耐利福平株也同時耐異煙肼，這樣單獨進(jìn)行利福平的藥物敏感性分析即可初步判定細(xì)菌的耐藥譜，因而可作為耐多藥的篩選指標(biāo)。

【參考文獻(xiàn)】

1 Roues DA，Li ZM，Bai GH，et al.Characterization of the KatG and inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of M.tuberculosis.Chemother，1995，39：2472.

2 Morris S，Bai GH，Suffys P，et al.Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.JID，1995，171：954.

3 Williams D，Waguespack C，Eisenack K，et al. Characterization of rifampin in pathogenic Mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother，1994，38：2380-2386.

4 Baneriee A，Dubnau A，Quemard V，et al.InhA，a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis.Science，1994，263(5114)：227.

5 lison TM，Collins DM.Ahpc，a gene involved in isoniazid resistance of theMycobacterium Complex.Mol Microbiol，1996，19：1025.

6 Kapur V，Li LL，Iordanescu S，et al.Characterization by automated DNA Sequencingof mutation in the gene(rPOB) encoding the RNA polymerase subunit in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis serains from New York City and Texas.ClinMicrobiol，1994，32：1095-1098.

7 莊玉輝，何秀云，張小剛，等.耐利福平結(jié)核分支桿菌耐藥分子機(jī)制的研究. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23：711-714.