作者：王姿媛，何澤民，姜笑寒

【摘要】 目的篩選超臨界CO2 流體萃取蓽澄茄揮發性成分的最佳工藝，并研究萃取物的藥效。方法采用正交實驗設計，以萃取物得率為指標，考察萃取壓力、萃取溫度、解析壓力及解析溫度4個因素的影響；采用體外抗菌實驗、抗致敏豚鼠回腸肌過敏性收縮反應實驗、醋酸扭體法實驗、小鼠自主活動次數影響試驗研究萃取物的主要藥效。結果最佳萃取工藝條件為萃取壓力25MPa，萃取溫度40℃，解析壓力8 MPa，解析溫度50℃；萃取物具有顯著的抑菌、抗過敏、鎮痛、鎮靜等藥理作用。結論超臨界CO2 流體萃取技術用于蓽澄茄揮發性成分提取，方法簡單可行，適用于工業化生產。蓽澄茄超臨界萃取物具有多方面的藥理作用，研究開發價值較大。

【關鍵詞】 蓽澄茄；超臨界二氧化碳萃??；藥理作用

Abstract：ObjectiveTo study the optimal technology of supercritical- CO2 fluid extraction(SFE-CO2) for Litsea cubeba (Lour.)Pres.and its pharmacodynamic effect.MethodsThe yield of extract was used as index to evaluate the technologies based on orthogonal design ， in which 4 factors considered were extraction temperature and pressure ， separation temperature and pressure;the animal models of bacteriostasis，anti-anaphylaxis， analgesia， conscious-sedation were used to study the function of the extract. ResultsThe optimum extraction conditions was extraction pressure 25MPa ， temperature 40℃， separation pressure 8MPa， temperature 50℃ ; The extract had good pharmacodynamic action of bacteriostasis，anti-anaphylaxis， analgesia and conscious-sedation. ConclusionSupercritical fluids extraction method is feasible for the activities of Litsea cubeba(Lour.)Pres.， and useful for the large scale production . The extract has significant functions in many ways and is worthy to further development.

Key words：Litsea cubeba (Lour.)Pres； SFE－CO2 ； Pharmacologic action

中藥蓽澄茄為樟科植物山雞椒Litsea cubeba (Lour.)Pres.的成熟果實。具有溫中散寒、行氣止痛的功效，用于胃寒脘腹冷痛、嘔吐、呃逆及寒疝腹痛等癥［1］?，F代藥理研究表明，蓽澄茄中的揮發性成分具有多方面的藥理作用［2］。目前針對其揮發性成分多采用水蒸氣蒸餾法提取。超臨界二氧化碳流體的極性相當于正己烷，適于萃取中藥中的低極性成分，且具有無溶劑殘留，工藝簡單，萃取時間短等優點。目前對蓽澄茄超臨界萃取研究未見報道，本研究以萃取率為指標，采用正交實驗設計，篩選蓽澄茄超臨界CO2 萃取的最佳工藝參數，并研究萃取物的藥效，為中藥蓽澄茄的進一步開發利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器HA231－50－06型超臨界萃取裝置，江蘇南通華安超臨界實業公司；YLS-IA多功能小鼠自主活動記錄儀，山東省醫學科學院設備站；蓽澄茄藥材購自廣州市清平藥材市場，經廣州中醫藥大學生藥教研室鑒定為蓽澄茄Litsea cubeba (Lour.)Pres.的干燥果實，粉碎成10～20目備用。

1.2 材料NIH種小鼠，體重18～22 g，購自廣東省衛生廳醫用動物中心。豚鼠（合格證號2006A004），普通級，購自廣東省實驗動物中心。清熱消炎寧：廣州敬修堂藥業有限公司生產，批號060114。鹽酸賽庚啶，2 mg/片，常州四藥制藥有限公司，批號060812。嗎啡注射液：沈陽第一制藥廠出品，批號931202。清開靈口服液：廣州明興制藥有限公司生產，批號20051101。菌種由北京中國藥品生物制品檢定所提供。冰乙酸等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 SFE－CO2法提取工藝的基本流程將200 g蓽澄茄粉末投入萃取釜中，對萃取釜、解析釜Ⅰ、貯罐分別進行加熱，當達到所選定的溫度時，開啟CO2氣瓶對系統進行加壓，當達到所選定的力時，開始循環萃取，并保持恒溫恒壓。待達到選定的萃取時間后，從解析釜Ⅰ出料口出料，得棕黃色的油狀蓽澄茄萃取物，計算萃取率(萃取率為每100 g藥材得到的提取物的量)。 表1 提取工藝4因素3水平正交實驗方案及結果（略）

2.2 正交實驗選擇萃取條件選擇萃取壓力（A）、萃取溫度（B）、解析壓力（C）、解析溫度（D）4個主要因素，各設定3個水平，設計4因素3水平正交實驗L9(34)，對蓽澄茄進行超臨界CO2萃取，萃取時間為3 h。因素水平及結果見表1，統計分析見表2。表2 萃取率方差分析（略）

以萃取率為指標，則優化工藝為A3B2C2D3，即萃取壓力25 MPa，萃取溫度40℃，解析壓力8 MPa，解析溫度50℃。方差分析結果表明，萃取壓力、萃取溫度和解析溫度是有顯著影響的因素，各因素影響大小的順序為A>B>D>C。

2.3 最佳工藝驗證實驗取蓽澄茄藥材15 kg（n＝3）按最佳工藝條件進行中試放大實驗，各批次的萃取率分別為3.13%，3.21%及3.15%，表明重復性良好，該工藝切實可行。

2.4 體外抗菌作用實驗將蓽澄茄萃取物以營養肉湯配制成每毫升含生藥量3.58，1.79，0.895 g……0.055 9 g，0.027 95 g共8個藥物濃度，每管總量2 ml，蒸氣滅菌。對鏈球菌的實驗尚需在滅菌藥液中添加1%葡萄糖，對肺炎鏈球菌則加10%滅活兔血清，每排藥液的各個濃度管及菌種對照管分別加入1∶2 000的試驗菌液（8 h培養物）0.2 ml，37℃培養18 h觀察結果。以濁度為指標肉眼觀測各管有無菌生長。判定最小抑菌濃度（MIC）。MIC是指完全抑制實驗菌種生長所含的最小藥物濃度。實驗結果見表3（注：菌種對照為不含藥物的培養基加試驗菌，藥物對照為不加試驗菌的藥液，陽性對照藥用清熱消炎寧）。表3 藥物的抑菌作用（略）

由表3可見蓽澄茄提取物對所試菌種均有不同程度的抗菌作用，對各菌的MIC介于0.050 9 g生藥/ml～1.79 g生藥/ml之間，其中對金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的作用較強。

2.5 鎮痛作用實驗小鼠雌雄各半，體重18～22 g，隨機分組，分別灌胃給藥（嗎啡組腹腔注射），1 h后（嗎啡30 min后），每只小鼠腹腔注射0.6%冰乙酸0.2 ml，記錄注射后20 min內小鼠因疼痛扭體的次數。結果見表4。表4 蓽澄茄萃取物對冰乙酸致小鼠疼痛扭體影響的實驗(略)

結果表明，蓽澄茄萃取物大、中、小劑量組小鼠扭體次數都少于空白組，差異有顯著性意義，提示蓽澄茄萃取物對冰乙酸所致的小鼠扭體疼痛有鎮痛作用。

2.6 抗致敏豚鼠回腸肌過敏性收縮反應實驗

取豚鼠10只，體重200～250 g。每只豚鼠兩后腿各肌注5%卵蛋白K-H液0.4 ml，同時腹腔注射該溶液1.0 ml以致敏，3周后將豚鼠放血處死，剖腹取回腸，剪成1 cm左右腸段，置入盛有K-H液10 ml的浴槽中，一端固定于浴槽底部的固定鉤上，另一端與拉力換能器相連，記錄收縮張力（g）。前負荷(1.0～1.5)g，恒溫(37±1)℃，平衡15 min后開始實驗。實驗分為模型組（即生理鹽水組）、鹽酸賽庚啶組，蓽澄茄提取物低、中、高劑量組，各組給藥0.1 ml，給藥后所達到藥物濃度為表中所示。給藥后，待藥物與標本接觸5 min后，向浴槽內加入5 mg/ml卵蛋白K－H液0.1 ml進行抗原攻擊，比較各組回腸收縮張力的差別，用t檢驗比較各組差異，結果見表5。表5 對卵蛋白致敏豚鼠離體回腸肌過敏性收縮反應抑制程度(略) 表5結果表明，模型對照組用抗原攻擊后可產生明顯收縮反應，與模型對照組比較，鹽酸賽庚啶組、蓽澄茄提取物低、中、高劑量組，均顯著抑制其收縮反應（P<0.01），提示各藥物實驗組均有明顯的抗過敏作用。與鹽酸賽庚啶組比較，蓽澄茄提取物中劑量組比較無差異(P>0.05)，提示蓽澄茄提取物抗過敏作用與鹽酸賽庚啶組相當。

2.7 鎮靜實驗－對小鼠自主活動次數的影響實驗

取NIH小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機分為5組，每組10只，即為空白對照組、清開靈口服液組、蓽澄茄提取物低、中、高劑量組。 除空白對照組外，各組按表6劑量分別灌胃給藥，空白對照組給予等容積蒸餾水，每天給藥1次，連續4 d。末次給藥1，2 h后，將小鼠置小動物自主活動儀中，使其適應3 min后，記錄5 min內活動次數，采用重復測量的方差分析進行組間比較結果見表6。表6 對小鼠自主活動的影響(略)

表6結果表明，與空白對照組比較，清開靈口服液組、蓽澄茄提取物低、中、高劑量組，均能顯著減少小鼠5 min內的自主活動次數（P<0.01），提示各實驗組均有較好的鎮靜作用。與清開靈口服液組比較，蓽澄茄提取物高、中劑量組給藥2 h后對減少小鼠5 min內的自主活動次數均有差異（P<0.05），提示蓽澄茄提取物鎮靜作用強度相當于清開靈口服液。

3 討論

超臨界萃取法比常規水蒸氣蒸餾法的萃取效率高，且無溶劑殘留，有利于環境保護，工藝簡單、萃取時間短。目前已廣泛應用于中藥材的提取中，成為中藥現代化進程中的一項重要技術。本實驗采用超臨界技術提取的蓽澄茄提取物為棕黃色的油狀物，有效成分被高度濃縮，有利于本品的進一步開發利用。

本實驗在工藝優化時，考察了溫度和壓力等主要因素。另外，二氧化碳流量也是重要的影響因素。CO2流量［升/（秒·千克原料）］的變化對超臨界流體萃取過程的影響較復雜。當加大CO2流量，會產生有利和不利兩方面的影響。在實際應用中，我們根據成本和效率的原則確定萃取過程的流量。 蓽澄茄成人臨床用量為生藥量0.35 g/kg體重。藥效實驗時用50%聚乙二醇400配制成所需濃度，按15.75，5.25，1.75 g生藥量/kg劑量給藥，相當于臨床用量的45，15，5倍。 本實驗結果表明，蓽澄茄超臨界提取物具有顯著的抑菌、鎮痛、鎮靜、抗過敏作用，且毒性低，從而驗證了蓽澄茄超臨界流體萃取工藝的合理性，同時也為蓽澄茄的制劑工藝及活性成分的研究奠定了良好的基礎。