作者：羅宇慧 彭蘊(yùn)茹 葉其正 王志剛 石磊 沈明勤

【摘要】 目的觀察瘰疬清膠囊對(duì)動(dòng)物的止咳、抗炎及提高機(jī)體免疫力的作用。方法①小鼠灌胃瘰疬清膠囊16.0，8.0和4.0 g生藥/kg后，采用濃氨水噴霧法進(jìn)行止咳實(shí)驗(yàn)，觀察動(dòng)物咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)。②大鼠灌胃瘰疬清膠囊8.0，4.0和2.0 g生藥/kg的后，采用大鼠慢性炎癥瓊脂肉芽腫法，觀察肉芽腫濕重及抑制率的變化，采用角叉菜膠致大鼠足腫脹法，測(cè)定大鼠足腫脹度及足腫脹抑制率。③注射環(huán)磷酰胺（CY）造成小鼠免疫功能低下模型，觀察灌胃瘰疬清膠囊16.0，8.0和4.0 g生藥/kg后，小鼠免疫功能的改變。結(jié)果瘰疬清膠囊能明顯延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)，對(duì)大鼠慢性炎癥瓊脂肉芽腫具有一定的抑制作用，對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹具有一定的抑制作用，瘰疬清膠囊能明顯對(duì)抗CY作用，提高免疫抑制小鼠的免疫功能。結(jié)論瘰疬清膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有一定的止咳、抗炎及提高機(jī)體免疫力的作用。

【關(guān)鍵詞】 瘰疬清膠囊； 動(dòng)物； 止咳； 抗炎； 免疫功能

瘰疬清膠囊由生牡蠣、夏枯草、七葉一枝花、玄參等組成，臨床上主要用于治療瘰疬，頸部淋巴結(jié)核。本實(shí)驗(yàn)主要觀察瘰疬清膠囊對(duì)動(dòng)物的止咳、抗炎及提高機(jī)體免疫力的作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 器材

1.1 動(dòng)物清潔級(jí)KM小鼠：♀♂兼有，體重18～22 g；清潔級(jí)SD大鼠：♂，體重280～360 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2002-0010號(hào)。

1.2 試藥瘰疬清膠囊（干粉）：含6.88 g生藥/g，批號(hào)20030718，江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究室提供。枸櫞酸噴托維林片（咳必清）：每片含枸櫞酸噴托維林25 mg，批號(hào)020118-2，蘇州醫(yī)藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。濃氨水：分析純，批號(hào)981125，益林化工廠生產(chǎn)。乙酰水楊酸腸溶片(阿司匹林)：25 mg/片，批號(hào)20020404，南京第二制藥廠生產(chǎn)，使用時(shí)以蒸餾水配成濃度為10 mg/ml的藥液供灌胃給藥。瓊脂：批號(hào)980424，中國(guó)藥品生物制品檢定所。角叉菜膠(TypeⅠ)：批號(hào)232-524-2，美國(guó)SIGMA公司生產(chǎn)。環(huán)磷酰胺粉針(CY)：200 mg/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2003041521。鹽酸左旋咪唑片：25 mg/片，南京第二制藥廠，批號(hào)20010104。5%雞紅細(xì)胞懸液的制備：由市售肉雞采血約10 ml，以肝素生理鹽水抗凝，再按1∶1加入注射用0.9% NaCl液(NS)，充分混勻洗滌后，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，余下的紅細(xì)胞再洗滌2～3次。取洗凈離心后的紅細(xì)胞4 ml，用NS液配制成5%濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器S-888型超聲波霧化器，中外合資道芬電子有限公司生產(chǎn)；PB303-N千分之一電子天平 上海產(chǎn)；隔水式電熱水浴箱；BH-2OLYMPUS顯微鏡：日本進(jìn)口。

2 方法

2.1 小鼠止咳實(shí)驗(yàn)［1～4］取小鼠50只，稱重，隨機(jī)分為5組，每組10只，♀♂各半，分別為模型對(duì)照組（蒸餾水20 ml/kg）、陽(yáng)性藥咳必清對(duì)照組(0.05 g/kg)和瘰疬清膠囊大、中、小劑量組(16.0，8.0和4.0 g生藥/kg)。各組動(dòng)物灌胃(ig)給藥，給藥量均為20 ml/kg，給藥1 h后各動(dòng)物分別置于噴霧箱內(nèi)，用超聲波霧化器以相同強(qiáng)度將濃氨水霧化后噴入活動(dòng)箱內(nèi)，噴霧1 5 s后，立即觀察動(dòng)物咳嗽潛伏期（在吸入氨水氣霧后至發(fā)生咳嗽所需時(shí)間為潛伏期），并記錄2 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，各給藥組與模型對(duì)照組進(jìn)行組間t－檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.2 大鼠肉芽腫實(shí)驗(yàn)［1～4］肉芽腫模型：大鼠背部中線處取2.0 cm×2.0 cm面積脫毛，消毒，皮下注射2%瓊脂(56℃水浴保溫)2 ml，注射后立即凸起球狀包塊即成。隔日取50只肉芽腫模型大鼠，全♂，隨機(jī)分5組，每組10只，分別為模型對(duì)照組(蒸餾水10 ml/kg)、陽(yáng)性藥阿司匹林組(0.1 g/kg)、瘰疬清膠囊大、中、小3個(gè)劑量組 (8.0，4.0和2.0 g生藥/kg)。各組動(dòng)物ig給藥，給藥量均為10 ml/kg。ig 1次/d，連續(xù)給藥7 d，每日觀察肉芽腫變化，末次藥后1 h脫椎處死大鼠，剪開(kāi)肉芽部位皮膚，剝離肉芽腫瓊脂塊，稱取濕重，各給藥組與模型對(duì)照組進(jìn)行組間t－檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。肉芽腫抑制率(%)按下列公式計(jì)算： 抑制率（%） =模型對(duì)照組均值 - 給藥組均值模型對(duì)照組均值 ×100%

2.3 大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn) ［1～4］取大鼠50只，稱重，隨機(jī)分為5組，每組10只，全♂，分別為模型對(duì)照組（蒸餾水10 ml/kg）、阿司匹林組（0.1 g/kg）、瘰疬清膠囊大、中、小3個(gè)劑量組(8.0，4.0和2.0 g生藥/kg)。給藥量均為10 ml/kg。用足跖測(cè)定器測(cè)量每只大鼠左后肢正常足跖容積（10 ml注射器，上口刻有標(biāo)記，內(nèi)含中性洗滌劑的水溶液，通過(guò)硬塑料管連接另一5 ml注射器），用記號(hào)筆在大鼠左后肢踝關(guān)節(jié)周圍做一標(biāo)記，將大鼠左后肢浸入容器，使注射器上口標(biāo)記與大鼠后肢關(guān)節(jié)標(biāo)記和液面重疊，多余液體則抽入5 ml注射器內(nèi)，抽入注射器內(nèi)的液體量即為足跖容積。測(cè)量完給藥前的正常足跖容積后，各組動(dòng)物ig給藥，30 min后，于左后肢足跖皮下注入1%角叉菜膠0.1 ml，注射0.5 h后（給藥后1 h）按上述方法測(cè)量0.5，1，2，4，6，8 h的足跖容積，記錄結(jié)果，并分別按下式計(jì)算腫脹率（%）和抑制率（%）。各給藥組與模型對(duì)照組進(jìn)行t－檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。 腫脹率（%）=致炎后足跖容積－致炎前足跖容積 致炎前足跖容積×100% 抑制率（%） =對(duì)照組平均腫脹度 - 給藥組平均腫脹度對(duì)照組平均腫脹度×100%

2.4 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)

2.4.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)取小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只， ♀♂各半。分別為正常組和環(huán)磷酰胺（CY）模型組(蒸餾水20 ml/kg)、陽(yáng)性藥左旋咪唑組(25 mg/kg)、瘰疬清膠囊大、中、小劑量組(16.0，8.0和4.0 g生藥/kg)。各組動(dòng)物灌胃(ig)給藥，給藥量均為20 ml/kg，ig 1次/d，連續(xù)給藥7 d，第5天除正常對(duì)照組外，每組動(dòng)物腹腔注射CY 40 mg/kg (0.1 ml/10 g)，第6天各重復(fù)注射1次，末次給藥后1 h小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.5 ml/只。再經(jīng)2 h后脫頸椎處死動(dòng)物，酒精消毒腹部，腹腔注射生理鹽水2 ml，輕揉腹部，剪開(kāi)皮膚，暴露腹膜，剪一小口用消毒吸管吸取腹腔細(xì)胞懸液0.2 ml，涂敷于玻片上，然后將玻片平放于潮濕的培養(yǎng)皿內(nèi)在37℃的孵育箱內(nèi)孵育30 min。再用NS沖洗去未粘附的細(xì)胞，待自然晾干后，甲醇固定15 min，姬氏染色，計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，按下列公式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。各給藥組與模型對(duì)照組進(jìn)行t－檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。 吞噬百分率 （%）= 吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)觀察的100個(gè)巨噬細(xì)胞數(shù)×100%

2.4.2 小鼠PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)取小鼠60只，體重18～22 g，隨機(jī)分為6組，每組10只， ♀♂各半。分別為正常組和CY模型組(蒸餾水20 ml/kg)、陽(yáng)性藥左旋咪唑組(25 mg/kg)、瘰疬清膠囊大、中、小劑量組(16.0，8.0和4.0 g生藥/kg)，其中瘰疬清膠囊大劑量相當(dāng)于擬臨床人日用量的24倍。將供試藥品在超凈工作臺(tái)中配成相應(yīng)濃度并紫外線消毒后，各組動(dòng)物灌胃(ig)給藥，給藥量均為20 ml/kg，ig1次/d，連續(xù)給藥8 d，于給藥第1天起，每只小鼠每天肌內(nèi)注射PHA 10 mg/kg ( 0.1 ml/20 g)，共3 d，第6天除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物腹腔注射CY 40 mg/kg(0.1 ml/10 g)，第7天重復(fù)注射1次，末次藥后1 h小鼠眼眶后靜脈叢取血，推片，甲醇固定，姬氏染色，水洗，晾干，高倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞中淋巴母細(xì)胞數(shù)，按下式計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。各給藥組與模型對(duì)照組進(jìn)行t－檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 （%）= 轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)×100%

2.4.3 小鼠血清溶血素水平測(cè)定取小鼠60只，體重18～22 g，隨機(jī)分為6組，每組10只， ♀♂各半。分別為正常組、CY模型組(蒸餾水20 ml/kg)、陽(yáng)性藥左旋咪唑組(25 mg/kg)、瘰疬清膠囊大、中、小劑量組(16.0，8.0和4.0 g生藥/kg)。將供試藥品在超凈工作臺(tái)中配成相應(yīng)濃度并紫外線消毒后，各組動(dòng)物灌胃(ig)給藥，給藥量均為20 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥12 d，于給藥后第5天各組動(dòng)物腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.2 ml/只進(jìn)行免疫，再于給藥后第10天除正常對(duì)照組外，每組動(dòng)物腹腔注射CY 40 mg/kg (0.1 ml/10 g)，第11天重復(fù)注射1次，末次給藥后1 h小鼠眼眶后靜脈叢取血，離心，取10 μl血清用生理鹽水稀釋100倍，與5%雞紅細(xì)胞懸液0.5 ml及10%補(bǔ)體0.5 ml混合，37℃恒溫水浴中保溫30 min后，0℃冰水浴中終止反應(yīng)，離心，取上清液于貝克曼DU640型紫外分光光度計(jì)540 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)光密度(OD)值，另設(shè)不加血清的空白對(duì)照，取上清液作為比色時(shí)調(diào)0的基準(zhǔn)。以O(shè)D值作為判定血清溶血素水平的指標(biāo)。各給藥組與模型對(duì)照組進(jìn)行t－檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。

2.4.4 小鼠血清免疫球蛋白水平測(cè)定取小鼠60只，體重18～22 g，隨機(jī)分為6組，每組10只，♀♂各半。分別為正常組和CY模型組(蒸餾水20 ml/kg)、陽(yáng)性藥左旋咪唑組(25 mg/kg)、瘰疬清膠囊大、中、小劑量組(16.0，8.0和4.0 g生藥/kg)，其中瘰疬清膠囊大劑量相當(dāng)于擬臨床人日用量的24倍。將供試藥品在超凈工作臺(tái)中配成相應(yīng)濃度并紫外線消毒后，各組動(dòng)物灌胃(ig)給藥，給藥量均為20 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥8 d，于給藥后第6天除正常對(duì)照組外，每組動(dòng)物腹腔注射CY 40 mg/kg (0.1 ml/10 g)，第7天各重復(fù)注射1次，末次給藥后1 h小鼠眼眶后靜脈叢取血，離心，取血清按免疫球蛋白IgG，IgA，IgM測(cè)定試劑盒操作方法，于貝克曼DU640型紫外分光光度計(jì)340 nm處比色，測(cè)光密度(OD)值，生理鹽水作為比色時(shí)調(diào)0的基準(zhǔn)。以標(biāo)準(zhǔn)管OD值計(jì)算結(jié)果。各給藥組與模型對(duì)照組比較進(jìn)行t－檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。

3 結(jié)果

3.1 瘰疬清膠囊止咳實(shí)驗(yàn)瘰疬清膠囊各給藥組與模型對(duì)照組比效，均能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期（P<0.05，P<0.01）；2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)明顯減少（P<0.001）。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果提示瘰疬清膠囊口服給藥能明顯延長(zhǎng)咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)，對(duì)小鼠具有明顯的止咳作用。

3.2 大鼠肉芽腫實(shí)驗(yàn)瘰疬清膠囊大、中、小劑量組的肉芽腫瓊脂塊與模型對(duì)照組相比，均有顯著減小(P<0.01，P<0.001)；抑制率達(dá)26.5%以上，表明其灌胃給藥對(duì)慢性炎癥性肉芽腫具有明顯的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)瘰疬清膠囊大、中、小劑量組有明顯的抗炎作用。大、中劑量組致炎后4～8 h，小劑量組致炎后6～8 h的足跖腫脹率與模型對(duì)照組相比，均有顯著降低（P<0.05～0.001）。足腫脹抑制率與模型組比較，大、中、小劑量組4～8 h大于29.7%。結(jié)果表明，瘰疬清膠囊對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹具有一定的抗炎作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。小鼠CY造模后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能明顯降低（P<0.01）， 瘰疬清膠囊大、中劑量組均能增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能（P<0.05～0.01），并呈一定的量效關(guān)系。 結(jié)果表明，瘰疬清膠囊能增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，對(duì)免疫功能低下的小鼠具有增加免疫功能的作用。 瘰疬清膠囊各給藥組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05～0.001)并呈一定的量效關(guān)系，表明瘰疬清膠囊對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有明顯的增強(qiáng)作用。 小鼠腹腔注射CY后，使雞紅細(xì)胞所致的血清溶血素水平明顯降低(P<0.001)，瘰疬清膠囊能明顯對(duì)抗CY作用， 其中大、中劑量組能顯著提高小鼠血清溶血素水平(P<0.01)。 小鼠腹腔注射CY后，血清免疫球蛋白IgG，IgA，IgM水平明顯降低(P<0.01～0.001)，瘰疬清膠囊能明顯對(duì)抗CY作用， 其中中劑量組IgG水平，大、中劑量組IgA水平，大劑量組IgM水平明顯提高(P<0.05)。結(jié)果表明瘰疬清膠囊能提高小鼠體液免疫功能。

表1 瘰疬清膠囊止咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n = 10

表2 瘰疬清膠囊對(duì)大鼠慢性炎癥瓊脂肉芽腫的影響（略）

與模型對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001；n=10

表3 瘰疬清膠囊對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響（略）

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；（）為抑腫率；n=10

表4 瘰疬清膠囊對(duì)小鼠免疫功能的影響（略）

模型組比較 ，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n=10

4 討論 瘰疬清膠囊臨床上長(zhǎng)期用于治療瘰疬、頸部淋巴結(jié)核等。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該藥能明顯延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)，對(duì)大鼠慢性炎癥瓊脂肉芽腫具有一定的抑制作用，對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹具有一定的抑制作用，瘰疬清膠囊能明顯對(duì)抗CY作用，提高免疫抑制小鼠的免疫功能，進(jìn)一步為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。