作者：杜一民， 陳鴻珊 ， 李樹楠， 李壯， 李小兵， 張華明， 方春生

【關鍵詞】 肝龍膠囊；，，鴨乙型肝炎病毒；，，鴨乙肝動物模型；，，實驗性肝損傷；，，美洲大蠊

摘要：目的觀察肝龍膠囊對鴨乙型肝炎病毒的抑制效果和對實驗性肝損傷的保護作用。方法（1）以鴨乙型肝炎病毒（DHBV）靜脈注射感染雛鴨為模型，于感染第7天后分組灌胃肝龍（GL）膠囊浸膏0.5，1.5，3.0 g?kg1?d1，陽性對照組給予無環鳥苷(ACV)或磷羧基甲酸鈉(PFA)。采用斑點雜交方法檢測鴨血清DHBVDNA，以病毒抑制率為療效指標；（2）以昆明種小鼠腹腔注射CCl4肝損傷為模型，給予GL浸膏(200 mg?kg1)。測定SGPT值，并取肝臟作病理形態學觀察。結果（1）GL三個不同劑量組對DHBV均有不同程度的抑制作用，有一定的量效關系；（2）GL降低CCl4肝損傷小鼠血清SGPT值并減輕肝細胞損傷。結論肝龍膠囊可抑制雛鴨體內DHBVDNA的復制并能保護CCl4所致的小鼠肝損傷。

關鍵詞：肝龍膠囊； 鴨乙型肝炎病毒； 鴨乙肝動物模型； 實驗性肝損傷； 美洲大蠊

The Hepatic Pharmacological Effects of Ganlong Capsules in vivo.

Abstract：ObjectiveTo observe the antiviral activity of Ganlong Capsule against duck Hepatitis B virus( DHBV) and its protective effects on experimental liver injury in vivo.Methods(1) Experimental researches on antiviral activity of Ganlong Capsules against duck hepatitis B virus: The duck Hepatitis B model was made by injecting DHBV into the veins of one-day-old Beijing duck on the seventh day after infected by DHBV， Ganlong Capsule was given by intragastric administration for 10 days to group I (0.5 g?kg1?d1)， group II(1.5 g?kg1?d1)， group III(3.0 g?kg1?d1)， bid×10 d， and detected the levels of DHBV-DNA in the duck blood sera obtained separately on the day before giving Ganlong Capsule， the fifth day and tenth day after giving Ganlong Capsule， and the third day after withdrawing Ganlong Capsule， by serum dotblot hybridization. The trial was compared with acyclovor(ACV) or phosphonoformate(PFA). (2) Protective effects of Ganlong capsule on experimental liver injury in mice: Acute hepatic injury was induced by intraperitoneal injection of 0.2% CCl4 10 ml?kg1， Ganlong(200 mg?kg1) was given by intragastric or intraperitoneal administration for 2 days， bid. The serum SGPT were examined and the histopathological changes of hepatic tissue was measured.Results(1)The results of three experiments showed that the levels of sera DHBVDNA decreased in the treatment groups of Ganlong， and in a dose-effect manner. The group III(3.0 g?kg1?d1) inhibited (P<0.01) the serum DHBVDNA significantly， and after stopping the treatment for 6 days， serum DHBV-DNA level did not return significantly， and the inhibit effects were no different，compared with the treatment group of phosphonoformate(PFA) or acyclovor(ACV). (2) Ganlong(200 mg?kg1) could obviously inhibit the increase of serum SGPT， and histological examination showed that hepatic damages of Ganlong treated mice were less severe than those of CCl4 control group.ConclusionThese results suggested that Ganlong Capsule markedly inhibited duck hepatitis virus replication and had protective effects on experimental hepatic injury in vivo.

Key words：Ganglong Capsule; Hepatitis B virus; Animal hepatitis model; Experimental hepatic injury； Periplaneta americana L. 我國是乙肝高發國之一，乙型肝炎感染率高、危害嚴重。目前，用于治療乙肝的藥物有數百種，但仍缺乏理想的防治藥物。云南大理學院研制的治療乙肝的新藥肝龍膠囊，是國家實行新藥研究開發登記備案制以來，國家食品藥品監督管理局正式登記在案的抗肝炎中藥新藥［1］，具有療效較好、價廉、給藥方便、無副作用等優點［2］，目前已經完成臨床試驗，正在申請試生產。該藥由提取自昆蟲美洲大蠊Periplaneta americana L.的活性成分研制，對實驗性肝損傷有一定的保護作用，并能抑制雛鴨體內鴨乙型肝炎病毒的復制。現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 藥物 肝龍膠囊和肝龍浸膏由云南大理醫學院藥理教研室研制，浸膏干粉用生理鹽水配成所需濃度或制成注射液；陽性對照藥物無環鳥苷(ACV)粉劑由湖北醫藥工業研究院提供，磷羧基甲酸鈉（PFA）粉劑由上海第十二制藥廠提供，臨用前均生理鹽水配成所需濃度。

1.2 鴨乙型肝炎病毒 自然感染鴨乙型肝炎病毒的上海麻鴨血清，選用DHBVDNA強陽性者(+++)，70℃保存備用。

1.3 動物 1日齡北京鴨，購自北京禽蛋養鴨場；昆明種小鼠，購自云南醫學實驗動物中心，體重18~22 g，雌雄兼有。

1.4 主要試劑DHBVDNA探針：克隆自安徽廬江鴨DHBV全基因組（LJ76株）質粒，由中國醫學科學院生物技術研究所提供，α32PdCTP標記探針，購自北京福瑞生物技術工程公司；缺口翻譯藥盒購自普洛麥格公司(Promega Co.)；Sephadex G50、Ficoll、PVP，購自瑞典Pharmacia公司；SDS為西德Merck公司產品；魚精DNA、牛血清白蛋白為中國科學院生物物理所產品。硝酸纖維膜(0.45 μm)，美國MSI公司產品。四氯化碳(CCl4)溶于芝麻油，濃度為0.2%。

2 方法

2.1 抑制雛鴨體內鴨乙型肝炎病毒的復制實驗

2.1.1 鴨乙型肝炎病毒感染 孵出24 h之內的北京鴨，經靜脈注射上海麻鴨DHBVDNA陽性鴨血清，每只0.2 ml，在感染后7 d取血，分離血清，70℃保存待檢。

2.1.2 藥物治療實驗感染DHBV 7 d后雛鴨分組進行藥物治療實驗，每組6~8只；GL按3個劑量組口服給藥，分別為0.5，1.5，3.0 g?kg1?d1，bid×10 d；同批實驗設病毒對照組以生理鹽水代替藥物；陽性藥物對照組用ACV（0.4 g?kg1?d1）或PFA（0.5 g?kg1?d1）；各組分別在用藥前(T0)、用藥第5天(T5)、用藥第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，70℃保存待檢。共進行3批試驗，其中第3批實驗觀察GL的作用持續時間，并于停藥后第8天再取血1次。

2.1.3 DHBV-DNA檢測方法取上述待檢血清，每批各組樣品同時點膜（30 μl），測定鴨血清中DHBVDNA水平參照文獻［3］進行。按缺口翻譯試劑盒說明方法，用32P標記DHBVDNA探針，作鴨血清斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，用DG3022型酶標檢測儀測定光密度值(OD值)(λ=490 nm)，以雜交斑點OD值作為鴨血清DHBVDNA水平值。

2.2 對CCl4所致小鼠肝損傷的保護作用實驗

2.2.1 對CCl4所致小鼠肝損傷的預防作用及肝組織病理形態學觀察 小鼠30只，隨機分為3組，每組雄性8只，雌性2只。第1組作為對照組（給予生理鹽水20 ml?kg1，ip，bid×2d）；第2，3組給予肝龍浸膏制劑，劑量均為200 mg?kg1，bid×2d，其中第2組給藥途徑為腹腔注射（ip），第3組為灌胃（ig）；于實驗第3天，各組均給予0.2%CCl4芝麻油10 ml?kg1，ip。18 h后，全部小鼠眼眶取血，1 500 r/min離心分離血清，用賴氏法測定SGPT值。并取肝臟，用10%福爾馬林固定，作病理形態學觀察。為比較病理損害情況，將肝臟病損嚴重程度分為四級：(-)未見病變；(+)偶見個別肝細胞腫脹，少數炎癥細胞呈小灶性浸潤，(++)部分肝細胞腫脹，嗜酸性變，少數細胞壞死，以肝小葉中央靜脈周圍較為明顯，并有少量炎癥細胞浸潤；(+++)肝小葉中央靜脈擴張，小葉中央肝細胞變性壞死，壞死區約占小葉1/3至1/2，壞死區內有炎癥細胞浸潤，肝小葉周圍偶見壞死灶。

2.2.2 對CCl4所致小鼠肝損害的治療作用實驗 小鼠30只，隨機分為3組，每組雄性7只，雌性3只，實驗第1天各組均給予0.2%CCl4芝麻油10 ml?kg1，ip。8 h后，第2，3組開始分別給予肝龍浸膏治療，劑量均為200 mg?kg1，bid×2d。其中第2組給藥途徑為腹腔注射（ip），第3組為灌胃（ig）；第1組給予生理鹽水20 ml?kg1，ip，bid×2d，作為對照組。實驗第4天眼眶取血，測SGPT，肝組織作病理形態學觀察，方法同前。

2.2.3 SGPT測定采用賴氏法［4］

2.3 結果處理和統計分析鴨血清DHBVDNA OD490 nm值和SGPT值均采用均值(±s)。計算每組鴨不同時間血清DHBVDNA OD490 nm均值，并將每組鴨用藥后第5天、第10天和停藥后第3天血清DHBVDNA水平與給藥前比較，計算每組鴨用藥后不同時間和停藥后血清DHBVDNA的抑制率。DHBVDNA抑制率(I％)=［(給藥前OD值給藥后OD值)/給藥前OD值］×100％；統計學采用SPSS10.0軟件，單因素方差分析（OneWay ANOVA）。其中鴨血清DHBVDNA OD490 nm值將各給藥組不同時間DHBVDNA抑制率分別與病毒對照相同時間的同一指標比較，計算P1值，以確定療效。將各給藥組不同時間DHBVDNA抑制率分別與陽性藥物對照組相同時間的同一指標比較，計算P2值，比較GL與陽性藥物之間的藥效差別。

3 結果

3.1 GL對雛鴨體內鴨乙型肝炎病毒的抑制效果

3.1.1 1日齡北京鴨感染DHBV后血清DHBVDNA動態3批實驗結果，包括放射自顯影斑點雜交照片和各組不同時間鴨血清DHBVDNA抑制率。結果見表1。

表1 肝龍膠囊（GL）對DHBV感染雛鴨體內DHBVDNA的抑制作用(略)

給藥組治療不同時間的DHBVDNA抑制率分別與病毒對照組相應時間DHBVDNA的抑制率比較：＊ P1<0.05， ＊＊ P1<0.01；陽性對照組不同時間DHBVDNA的抑制率分別與GL各劑量組相應時間DHBVDNA的抑制率比較，＃ P2<0.05， ＃＃ P2<0.01從實驗結果可見，雛鴨感染DHBV后第7天血清DHBVDNA均呈陽性，在整個實驗過程中，病毒對照組鴨血清DHBVDNA水平雖有一定程度的波動，但無顯著性差異。說明數值差別為鴨個體差異所致自然波動。

3.1.2 陽性藥磷羧基甲酸鈉(PFA)和無環鳥苷(ACV)對DHBV感染鴨血清DHBVDNA的影響結果見表1。PFA給藥第5，10天和停藥后第3天對鴨血清DHBVDNA的抑制率分別為53.46%，80.65%和64.68%，ACV分別為65.87%，58.63%和34.15%。與病毒對照組比較均有顯著性差異，表明PFA和ACV作為抗DHBV陽性藥作用是明顯的。證明實驗方法可靠。

3.1.3 GL在DHBV感染鴨體內對鴨血清DHBVDNA的影響GCL大劑量組(3.0 g?kg1?d1 )，給藥后第10天鴨血清DHBVDNA抑制率3批實驗分別為61.75%，58.14%和71.12%，接近陽性藥對照組同一時間的抑制率。給藥后不同時間鴨血清DHBVDNA抑制率與病毒對照組比較，第2，3批實驗在T5時有非常顯著性差異(P<0.01)；第1，3批實驗在T10時有非常顯著性差異(P<0.01)；并且在停藥后(P3或P6)差異亦有顯著性。提示肝龍大劑量組對鴨血清DHBVDNA有明顯的抑制作用。療效顯著，并且作用持續時間較長。GL中、小劑量組3批實驗在T5，T10時均顯示對DHBVDNA有明顯的抑制作用。但與大劑量組比較，療效仍有一定的差距。表明GL的不同劑量組之間有一定的量效關系。

3.1.4 GL與陽性藥PFA和ACV的效果比較GL各劑量組與陽性藥PFA和ACV組的DHBVDNA抑制率比較，除第1批實驗的中、小劑量組分別在T5和T10明顯低于PFA外，第1批實驗的大劑量組及第2，3實驗的各劑量組不同時間的抑制率與PFA或ACV比較，差異均無統計學意義。

3.2 GL對CCl4所致小鼠肝損傷的保護作用

3.2.1 GL對CCl4所致小鼠肝損傷的預防作用及肝組織病理形態學觀察由表2可見，給小鼠GL（ip或ig）能對抗CCl4肝損害所引起的SGPT值升高，其中灌胃組有統計學意義。從肝臟損害程度看，給予GL能一定程度預防小鼠肝損傷，而CCl4 對照組均肝損傷嚴重(+++級)。

表2 預先給予肝龍浸膏對CCl4所致小鼠SGPT及其肝臟病理形態學的影響(略)

* P<0.05； ip: 腹腔注射給藥；ig: 灌胃給藥

3.2.2 GL對CCl4肝損害小鼠的治療作用由表3可見，肝龍可使受損肝組織恢復加速。腹腔注射肝龍組SGPT降低顯著，有統計學意義。肝臟病變程度，對照組10只均為(+++)級，而肝龍腹腔注射和灌胃組分別有3只和2只小鼠肝臟損傷程度較輕(++級)。

表3 肝龍浸膏對CCl4肝損害的治療作用及其肝臟病理形態學的影響(略)

* P<0.05； ip: 腹腔注射給藥；ig: 灌胃給藥

4 討論

治療肝炎的藥物主要是通過殺滅病毒、增強機體免疫功能、抗壞死、抗脂肪變性、抗炎、促再生、抗纖維化等機制發揮療效。CCl4所致肝損傷是其被還原而產生氧自由基，后者與膜脂質和膜蛋白共價結合引起肝細胞壞死［5］。本實驗證實肝龍有一定的抗壞死作用，能降低由CCl4所致的小鼠高SGPT值，病理形態觀察時還發現給予肝龍的某些小鼠受損肝臟有明顯再生加快現象。鴨乙型肝炎病毒（DHBV）與人乙型肝炎病毒同屬嗜肝病毒科，其病毒復制及致病性十分相似。以鴨乙型肝炎動物模型評價抗乙肝病毒藥物是一種較為有效而簡便的方法，己被作為篩選抗乙肝病毒新藥必做的藥效學方法。肝龍膠囊口服對鴨乙型肝炎病毒感染鴨血清DHBVDNA抑制作用研究的3批實驗結果顯示：肝龍0.5，1.5和3.0 g?kg1?d1 組對鴨乙型肝炎病毒感染鴨血清DHBVDNA均有明顯的抑制作用，尤以第III組(3.0 g?kg1?d1 )效果最好，與陽性藥PFA和ACV接近。以上實驗結果表明，肝龍對實驗性鴨乙型肝炎有一定的治療效果，初步臨床試驗也得到類似結果［2］。美洲大蠊屬于有翅亞綱外生翅類蜚蠊目，俗稱蟑螂。其生活環境骯臟，能攜帶并傳播50多種致病菌，自身卻不罹病。研究表明，與許多其他昆蟲一樣，蟑螂在長期的生存進化中形成了其獨特、有效的防御機能和適應能力，在外界物質的誘導下，能迅速產生抑殺多種細菌、真菌、病毒及原蟲，甚至癌細胞的物質［6，7］。肝龍膠囊就是利用現代工藝從美洲大蠊中提取的一組有效成分。從目前國內批準用于治療乙型肝炎的中藥品種上看，其中絕大部分來源于植物，而動物來源的極少［1］。肝龍膠囊療效較好、毒副作用很小是其特點。

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